限饲对妊娠中期母羊血液生化指标及内脏脂肪组织脂肪代谢的影响
限饲对妊娠中期母羊血液生化指标及内脏脂肪组织脂肪代谢的影响动物营养学报2018,30(6):2182⁃2193Chinese Journal of Animal Nutrition 杨 宏等:限饲对妊娠中期母羊血液生化指标及内脏脂肪组织脂肪代谢的影响6期2183 doi:10.3969/ j.issn.1006⁃267x.2018.06.021 限饲对妊娠中期母羊血液生化指标及 内脏脂肪组织脂肪代谢的影响 杨 宏1,2 周小玲1,2,3 颜琼娴1,4∗ 谭支良1,5 (1.中国科学院亚热带农业生态研究所,亚热带农业生态过程重点实验室,畜禽养殖污染控制与资源化技术国家 工程实验室,湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心,农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站;长沙 410125;2.中国科学院大学,北京 100049;3.塔里木大学动物科学学院,阿拉尔 843300;4.湖南省植物功能成分 利用协同创新中心,长沙 410128;5.湖南省畜禽安全生产协同创新中心,长沙 410128) 摘 要:本试验旨在研究限饲对妊娠中期母羊血液生化指标、内脏脂肪组织(VAT)脂肪酸组成 及脂肪代谢相关基因表达的影响。选取妊娠湘东黑山羊 16只,妊娠(45±3) d,体重(29.86±3.07) kg,随机分配至对照组(C组,100%妊娠营养需求)和限饲组(R组,60%妊娠营养需求),每组8只,试验期为妊娠45~100 d。妊娠101 d时,检测血液生化指标以及瘤胃网膜、肠系膜和 肾周脂肪组织中脂肪酸组成、脂肪代谢和能量感知相关基因的表达。结果表明,R组与 C组相 比:1)血液胰高血糖素、游离脂肪酸含量显著升高(P<0.05),血液瘦素、脂联素和高密度脂蛋白 胆固醇含量显著降低(P<0.05)。 2)网膜脂花生四烯酸、棕榈油酸、亚油酸、二十碳三烯酸和多 不饱和脂肪酸含量显著降低(P<0.05);系膜脂豆蔻酸含量显著降低(P<0.05);肾周脂亚油酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸和多不饱和脂肪酸含量显著降低(P<0.05)。 3)网膜脂腺苷酸活化 蛋白激酶的催化亚基 α2(AMPKα2)基因表达有上调的趋势(0.05≤P≤0.10);系膜脂脂肪酸合 成酶(FASN)、硬脂酰辅酶 A脱氢酶 1(SCD1)、解偶联蛋白 2(UCP2)基因表达有下调的趋势 (0.05≤P≤0.10),过氧化物酶体增殖激活受体 γ(PPARγ)基因表达有上调的趋势(0.05≤P≤0.10);肾周脂 FASN、UCP2基因表达显著下调(P<0.05),腺苷酸活化蛋白激酶的非催化亚基 β1(AMPKβ1)基因表达显著上调(P<0.05),肉碱脂酰转移酶1A(CPT1A)基因表达有上调的趋 势(0.05≤P≤0.10)。综上所述,妊娠中期限饲导致母羊血液中脂肪代谢调控因子(瘦素和脂联 素)含量下降,脂肪代谢产物(游离脂肪酸)含量上升,导致 VAT的脂肪酸组成(PUFA含量下 降),并经下调脂肪合成基因(FASN和 SCD1)、上调脂肪动员基因(CPT1A)及下调基础能量代 谢基因(UCP2)表达的途径,使母体 VAT脂肪合成作用减弱、脂质分解作用增强来调节机体能 量稳态。 关键词:限饲;妊娠中期;脂肪酸;脂肪代谢;山羊 中图分类号:S826 文献标识码:A 文章编号:1006⁃267X(2018)06⁃2182⁃12 由于天然饲草资源数量和品质、生产管理技 术及环境应激等因素限制,妊娠母羊易出现营养 供给不足。妊娠期母羊营养受限不仅影响母体妊 娠附属物的发育、后期繁殖性能、胎儿组织器官发 育及子代生长性能,而且对母体物质、能量代谢如 脂肪代谢也有重要影响[1-3]。前人对母体妊娠期 收稿日期:2017-12-04 基金项目:国家自然科学基金(31402105,31760678);中国科学院亚热带农业生态研究所青年创新团队(2017QNCXTD ZCS) 作者简介:杨 宏(1992—),男,土家族,湖南湘西人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。 E⁃mail: 742875934@qq.com ∗通信作者:颜琼娴,助理研究员,E⁃mail: yanqx14@isa.ac.cn 营养受限的研究主要集中在胚胎植入前后及妊娠 晚期,在生产中对母体的营养干预也主要在妊娠 晚期及泌乳阶段,对妊娠中期母体营养需要及能 量代谢的研究较少。妊娠中期是指妊娠 1/3~2/3阶段,这一时期是母体妊娠附属物发育和胎儿器 官形态建成及功能完善的重要时期14J,期间营养 受限时母体的代谢变化及可能的代偿机制对妊娠 中期营养需要研究及制订相应饲养管理策略具有 重要意义。 妊娠期母体营养受限,母体会动员自身营养 储备,尤其是脂肪组织供能来维持胚胎发育和自 身能量需求,以缓冲外界不良环境对胚胎发育的 影响。脂肪组织是机体重要的能量贮存器官,也 是重要的脂肪代谢调控器官。根据分布部位,脂 肪组织可以分为皮下脂肪组织和内脏脂肪组织 ( visceral adipose tissue,VAT)。 VAT 主要在瘤胃 网膜、肠系膜和肾周等分布,其相对于皮下脂肪组 织,细胞脂肪动员能力更强、速度更快,其代谢产 物能直接通过门静脉进入血液循环,进而影响机 体脂质代谢和能量代谢。内脏脂肪代谢与机体胰 岛素(INS)抵抗、脂肪代谢紊乱、糖尿病、脂肪肝、代 谢综合征等15-8」的产生密切相关。VAT动员和代谢 变化,是反映机体营养物质充足或缺乏的重要指征,也是机体对营养不足环境的重要应答路径。 本试验通过研究限饲对妊娠中期母羊脂肪代 谢相关血液生化指标、VAT脂肪酸组成及脂肪代 谢相关基因表达的影响,试图初步解析妊娠中期 低营养水平状态下妊娠母羊 VAT 脂肪动员及其 对机体脂肪代谢的影响机制。 1 材料与方法 1.1 试验动物及饲养管理 试验采用单因素随机区组试验设计。健康湘 东黑山羊16只,妊娠(45±3)d,体重(29.86±3.07) kg,随机分配至对照组(C 组,100%妊娠营 养需求)和限饲组(R组,60%妊娠营养需求),每 组8只。试验期为妊娠 45~100 d,试羊共接受 55 d试验处理,单栏饲养,饲粮精粗比 50:50,每日 等量饲喂2次(08:00和16:00),先精后粗,2组 基础饲粮相同,R组饲喂量为C组的60%,自由饮 水。限制期间母羊干物质采食量为:C组(1.14±0.04) kg/d,R组(0.60±0.02)kg/d, R 组实际限 饲量为C组的52%。限饲结束时母羊体增重为:C 组(5.9l±0.70)kg,R组(2.65±0.22)kg。基础饲 粮组成及营养水平见表1。 表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table l1Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 芒草 Miscanthus 50.00 玉米 Maize 33.50 豆粕 Soybean meal 10.33 脂肪粉 Fat power 4.00 碳酸钙 CaCO, 0.49 磷酸氢钙 CaHPO, 0.46 食盐 NaCl 0.22 预混料 Premix) 1.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 11.78 粗蛋白质 CP 12.05 粗脂肪 EE 8.97 中性洗涤纤维 NDF 64.44 酸性洗涤纤维 ADF 28.32 粗灰分 Ash 5.89 钙 Ca 0.53 磷P 0.20 1)每千克预混料含有 One kg of premix contained the following: MgSO4·H,O 119 g, FeSO4· 7H,O 2.5g, CuSO.·5H,0 0.8 g,MnSO·H,0 3 g,ZnSO·H,05 g, Na,SeO, 10 mg, KI 40 mg, CoCl,2·6H,0 30 mg, VA 95 000 IU,VD 17 500 IU,VE 18 000 IU。 2)代谢能为计算值,计算方法参考张宏福等199J」,其余指 标为实测值,测定方法参考张丽英等110]。ME was a calcu-lated value calculated using the method of Zhang et al, and the others were measured values measured using the methods of Zhang et al 10J 1.2 样品采集及分析 1.2.1 血样采集与分析 试验结束后,试羊空腹 24 h,于次日(妊娠 101 d)09:00 经颈静脉采血,肝素钠抗凝,室温静 置4 h,在4℃条件下以1200×g离心 10 min 分离 血浆,-20℃保存待测。血液葡萄糖(GLU)、甘油 三酯(TG)、总胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆 固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含 量采用日立7600全自动生化分析仪分析(试剂购 自北京利德曼生化股份有限公司)。血液INS、胰 高血糖素、瘦素(LEP)和脂联素(ADP)含量采用 酶联免疫法测定(试剂盒购自武汉华美生物工程 有限公司)。血液游离脂肪酸(FFA)含量采用试 剂盒测定(试剂盒购自南京建成生物工程研 究所)。 1.2.2 脂肪组织样本采集及分析 经颈动脉放血、剥皮开膛后,分离瘤胃网膜脂 肪组织(简称网膜脂)、肠系膜脂肪组织(简称系膜 脂)和肾周脂肪组织(简称肾周脂),经液氮速冻后 于-80 ℃冷冻保存。 1.2.2.1 脂肪酸含量测定 脂肪组织经冷冻干燥和研碎后,称取样品约 0.5 g,置于 50 mL离心管中,加入 4 mL苯-石油 醚混合溶剂(按体积比 1∶1混合),密闭浸提 24 h 后,加入4 mL氢氧化钾-甲醇溶液(0.4 mol/L)快 速甲酯化,振荡混匀 3 min后,静置 30 min。加入 超纯水分层,9 200×g离心10 min取上层溶液,加 入适量无水硫酸钠除去残留水分。取上述200 μL 上清液,加 800 μL正己烷稀释,经 0.22 μm滤膜 过滤后备测。采用 Agilent 7890A气相色谱仪 (Agilent公司,美国)检测上清液中脂肪酸含量,详 细步骤参见 Ichihara等[11]的方法。采用峰面积归 一化法来定量,各脂肪酸的含量以单个脂肪酸在 总甲酯化脂肪酸中所占的质量百分比表示。 1.2.2.2 实时定量 PCR(RT⁃PCR) 总 RNA提取:用 RNAios Plus试剂(TaKaRa 公司)提取总 RNA,方法见说明书,用超微量紫外 分光光度计于260 nm和1%变性琼脂糖凝胶电泳 测定总 RNA的浓度与纯度,以 260和 280 nm吸 光度值比值(OD260 nm/ OD280 nm)在 1.8~2.1的为总 RNA纯度较好,以电泳后 28S rRNA和 18S rRNA 的灰度值比2∶1为依据,评判提取总RNA的质量。 反转录:取 2 μg总 RNA采用 Prime ScriptRT reagent kit反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行反转 录反应,反应采用 40 μL体系,方法见说明书,反 转录产物 cDNA于-80 ℃保存备用。 引物设计:目的基因和内参基因 β-肌动蛋白 (β⁃actin)的引物使用 Primer premier 5.0软件根据 GenBank中发表的山羊基因序列设计,用 Primer⁃BLAST工具在线进行引物特异性分析。引物由上 海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序 列及参数见表2。 Table 2 Sequences and parameters of specific primers for RT⁃PCR 项目 引物序列 产物大小 登录号 Items Primer sequences (5′-3′) Produce size / bp Accession No. β-肌动蛋白 上游:ATGGCTACTGCTGCGTCGT 161 XM 018063603.1 β⁃actin 下游:TTGAAGGTGGTCTCGTGGAT 乙酰辅酶A羧化酶α ACCα 上游:ATGTGGATGATGGGCTGAA 139 XM 018064168.1 下游:GCTTGAACCTGTCGGAAGAG 酰基辅酶A氧化酶1 上游:ACCTGTGAGTTTGTGCCTGA 109 XM 018063769.1 ACOX1 下游:TTGGGCTGGAAAGATGCTAC 肉碱脂酰转移酶1A CPT1A 上游:TCATACTCGCTGGGAACAGA 111 XM 018043311.1 下游:TCTCGGAAGGAAACAAATGC 脂肪酸合成酶 FASN 上游:CGCCTCTCCTTCTTCTTTGA 107 NM 001285629.1 下游:CCTCTCTGGATGGCTTGGTA 激素敏感脂肪酶 HSL 上游:GAGGGTCATTGCCGACTT 160 XM 018062482.1 下游:CGTTGCGTTTGTAGTGCTC 肝X受体α LXRα 上游:TGCTGATGAAACTGGTGAGC 下游:TGAAGACACGGAGGAGGAAC 147 NM 001285751.1 过氧化物酶体增殖激活受体γ PPARγ 上游:CGGCTTTGTGAACCTTGACT 下游:GGATATGAGGACCCCATCCT 115 NM 001285658.1 硬脂酰辅酶A脱氢酶1 SCD1 上游:CTTCTCCGGTACGCTGTTGT 下游:CCCAGGGAAACCAGGATATT 122 NM 001285619.1 续表2 项目 引物序列 产物大小 登录号 Items Primer sequences (5′-3′) Produce size / bp Accession No. 肝激酶B1 上游:GGACACCTTCTCTGGCTTCA 下游:CCCTTCCCGATGTTCTCAA 126 XM 018050463.1 LKB1 解偶联蛋白1 上游:TGGGACACACAGCATCAGAC 156 XM 018061376.1 UCP1 下游:TAAAGGCACTGGAGGTCAGG 解偶联蛋白2 上游:GAGGTTGCAGGAATCGTCAT 120 XM 018058858.1 UCP2 下游:GGGAAAGGTGATGAGGTCAG 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α 上游:CCGAGAATTCATGGAGCAAT 184 XM 018049155.1 PGC⁃1α 下游:GATTGTGTGTGGGCCTTCTT 腺苷酸活化蛋白激酶的催化亚基α2 上游:TTGATGATGAGGTGGTGGAG 138 XM 018044652.1 AMPKα2 下游:CCGTGAGAGAGCCAGAGAGT 腺苷酸活化蛋白激酶的非催化亚基β1 上游:CCACCACATCTCCTCCAAGT 135 XM 013970630.2 AMPKβ1 下游:GAGCACCATCACTCCATCCT 使用荧光定量 PCR仪(ABI 7900 HT,ABI公 司,美国)进行 RT⁃PCR。采用 10 μL反应体系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5.0 μL,上游引物 (10 μmol/L) 0. 4 μL,下游引物(10 μmol/L)0.4 μL,cDNA模板 1.0 μL,dH2O(RNase Free)3.2 μL。反应条件:95 ℃ 30 s预变性;95 ℃ 5 s变 性,60 ℃ 20 s延伸,40个循环。熔解曲线分析:95 ℃ 5 s,65 ℃60 s。降温:50 ℃ 30 s。每个样本 3个重复。本试验中以 β⁃actin作为内参基因,以 对照组基因循环阈值(Ct)的平均值作为对照组 Ct,目的基因相对表达量计算采用2-△△Ct法。 1.3 数据统计与分析 所有试验数据经 Excel 2013软件整理后采用 SPSS 19.0软件进行 t检验统计分析,以P<0.05为 差异显著,以0.05≤P≤0.10为差异有显著趋势,P>0.10为差异不显著,结果以平均值(mean)及标 准误(SE)表示。 2 结 果 2.1 血液生化指标 由表3可知,与 C组相比,R组母羊血液中胰 高血糖素和 FFA含量显著升高(P<0.05),血液 LEP、ADP和 HDL⁃C含量显著下降(P<0.05),血 液 INS、GLU、TG、CHOL、LDL⁃C含量及 HDL⁃C/CHOL无显著变化(P>0.10)。 2.2 内脏脂肪组织脂肪酸组成 由表4可知,与 C组相比,R组网膜花生四烯 酸(C20 ∶ 4n6)、棕榈油酸 (C16 ∶ 1)、亚油酸 (C18 ∶2n6c)、二十碳三烯酸(C20∶3n6)和多不饱 和脂肪酸(PUFA)含量显著降低(P<0.05),网膜 豆蔻酸(C14∶0)和棕榈酸(C16∶0)含量分别有降 低和升高的趋势(0.05≤P≤0.10),检测的网膜其 余脂肪酸含量2组间无显著差异(P>0.10)。 由表5可知,与 C组相比,R组系膜豆蔻酸含 量显著降低(P<0.05),系膜亚油酸、α-亚麻酸 (C18∶3n6)、二十碳烯酸(C20∶1)、二十碳三烯酸 和 PUFA含量有降低的趋势(0.05≤P≤0.10),系 膜反式油酸(C18∶1n9t)含量有升高趋势(0.05≤P≤0.10),检测的系膜其余脂肪酸含量 2组间无 显著差异(P>0.10)。 由表 6可知,与 C组相比,R组肾周脂亚油 酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸和 PUFA含量显著 降低(P<0.05),肾周脂豆蔻酸含量有降低趋势 (0.05≤P≤0.10),检测的其余脂肪酸含量 2组间 无显著差异(P>0.10)。 2.3 内脏脂肪组织脂肪代谢相关基因表达 由表7可知,与 C组相比,R组网膜脂腺苷酸 活化蛋白激酶的催化亚基 α2(AMPKα2)基因表达 有上调的趋势(0.05≤P≤0.10),其余网膜脂基因 表达2组间无显著差异(P>0.10)。 表3 限饲对妊娠中期母羊血液生化指标的影响 Table 3 Effects of feeding restriction on blood biochemical indexes in mid⁃pregnancy dams 对照组 Control group 限饲组 Restriction group 项目 平均值 标准误 平均值 标准误 SE P值 P⁃value Mean SE Mean 胰岛素INS/(μIU /mL) 12.70 1.83 11.67 1.31 0.672 胰高血糖素 GLUC/(ng/L) 23.57 1.72 52.25 6.94 0.002 游离脂肪酸 FFA/(mmol/L) 0.44 0.01 0.58 0.01 0.007 瘦素 LEP/(ng/mL) 3.60 1.80 0.83 0.19 0.024 脂联素 ADP/(ng/mL) 1 771.24 192.03 1 061.80 106.38 0.012 葡萄糖 GLU/(mmol/L) 3.34 0.61 2.84 0.29 0.522 甘油三酯 TG/(mmol/L) 0.45 0.50 0.43 0.08 0.835 总胆固醇 CHOL/(mmol/L) 3.33 0.22 3.24 0.07 0.781 高密度脂蛋白胆固醇 HDL⁃C/(mmol/L) 2.01 0.11 1.69 0.09 0.044 低密度脂蛋白胆固醇 LDL⁃C/(mmol/L) 1.35 0.12 1.37 0.08 0.908 高密度脂蛋白胆固醇 /总胆固醇 HDL⁃C/CHOL 0.58 0.01 0.57 0.03 0.675 高密度脂蛋白胆固醇 /总胆固醇 HDL⁃C/CHOL 0.05≤P≤0.10为有差异趋势,P<0.05为差异显著。下表同。 0.05≤P≤0.10 indicated tendency of difference,and P<0.05 indicated significant difference. The same as below. 表4 限饲对妊娠中期母羊网膜脂脂肪酸组成的影响 Table 4 Effects of feeding restriction on fatty acid composition of omental adipose tissue in mid⁃pregnancy dams 对照组 Control group 限饲组 Restriction group 项目 平均值 标准误 平均值 Mean 标准误 SE P值 P⁃value Items Mean SE 豆蔻酸 C14∶0 2.624 7 0.098 3 2.349 6 0.097 4 0.076 棕榈酸 C16∶0 22.129 5 0.374 7 23.068 3 0.292 4 0.087 棕榈油酸 C16∶1 1.681 9 0.082 5 1.424 7 0.044 5 0.029 十七烷酸 C17∶0 2.026 0 0.104 8 1.807 4 0.094 6 0.161 硬脂酸 C18∶0 35.468 2 1.955 5 38.409 5 0.817 3 0.241 反式油酸 C18∶1n9t 4.708 3 0.290 0 5.452 1 0.313 6 0.110 油酸 C18∶1n9c 26.611 4 1.495 5 23.900 5 0.869 8 0.178 亚油酸 C18∶2n6c 3.372 3 0.263 2 2.472 0 0.256 7 0.034 γ-亚麻酸 C18∶3n6 0.038 5 0.007 1 0.041 6 0.003 9 0.713 α-亚麻酸 C18∶3n6 0.288 9 0.112 4 0.149 3 0.055 0 0.291 花生酸 C20∶0 0.129 8 0.037 0 0.179 9 0.051 1 0.430 二十碳烯酸 C20∶1 0.530 3 0.050 3 0.501 9 0.068 5 0.738 二十碳三烯酸 C20∶3n6 0.039 2 0.003 1 0.026 6 0.003 1 0.015 花生四烯酸 C20∶4n6 0.243 0 0.015 9 0.138 4 0.026 6 0.004 二十二碳六烯酸 DHA 0.108 0 0.017 0 0.078 2 0.028 1 0.357 饱和脂肪酸 SFA 62.378 2 1.756 3 65.814 7 0.661 1 0.132 单不饱和脂肪酸 MUFA 33.531 9 1.571 9 31.279 2 0.839 3 0.275 多不饱和脂肪酸 PUFA 4.089 9 0.375 9 2.906 1 0.285 1 0.036 饱和脂肪酸=豆蔻酸+棕榈酸+十七烷酸+硬脂酸+花生酸;单不饱和脂肪酸=棕榈油酸+反式油酸+油酸+二十碳烯酸;多不饱和脂肪酸=亚油酸+γ-亚麻酸+α-亚麻酸+二十碳三烯酸+花生四烯酸+二十二碳六烯酸。下表同。 SFA=C14∶0+C16∶0+C17∶0+C18∶0+C20∶0; MUFA=C16∶1+C18∶1n9t+C18∶1n9c+C20∶1; PUFA=C18∶2n6c+C18∶3n6+C20∶3n6+C20∶4n6+C22∶6n3. The same as below. 表5 限饲对妊娠中期母羊系膜脂脂肪酸组成的影响 Table 5 Effects of feeding restriction on fatty acid composition of mesenteric adipose tissue in mid⁃pregnancy dams % 项目 对照组 Control group 限饲组 Restriction group P值 平均值 标准误 平均值 标准误 Items P⁃value Mean SE Mean SE 豆蔻酸 C14∶0 2.760 5 0.118 2 2.424 2 0.066 2 0.043 棕榈酸 C16∶0 24.440 2 0.422 5 24.045 0 0.300 6 0.491 棕榈油酸 C16∶1 1.407 4 0.038 6 1.364 3 0.054 2 0.517 十七烷酸 C17∶0 1.918 0 0.074 6 1.824 4 0.093 5 0.444 硬脂酸 C18∶0 37.110 7 1.491 5 38.837 7 1.170 3 0.406 反式油酸 C18∶1n9t 4.694 1 0.186 5 5.348 9 0.312 6 0.082 油酸 C18∶1n9c 23.246 3 1.112 1 22.564 2 1.124 3 0.680 亚油酸 C18∶2n6c 3.051 1 0.201 2 2.481 0 0.250 8 0.098 γ-亚麻酸 C18∶3n6 0.045 0 0.006 6 0.039 5 0.006 3 0.563 α-亚麻酸 C18∶3n6 0.259 1 0.074 1 0.102 3 0.017 7 0.075 花生酸 C20∶0 0.184 8 0.049 3 0.250 7 0.055 3 0.393 二十碳烯酸 C20∶1 0.584 1 0.040 0 0.463 1 0.050 2 0.081 二十碳三烯酸 C20∶3n6 0.034 4 0.002 9 0.026 6 0.003 1 0.093 花生四烯酸 C20∶4n6 0.203 9 0.017 4 0.158 9 0.029 4 0.188 二十二碳六烯酸 DHA 0.060 6 0.007 8 0.069 3 0.025 7 0.757 饱和脂肪酸 SFA 66.414 1 1.275 2 67.382 0 1.224 0 0.604 单不饱和脂肪酸 MUFA 29.931 8 1.218 0 29.740 5 1.194 0 0.915 多不饱和脂肪酸 PUFA 3.654 1 0.255 2 2.877 5 0.297 6 0.071 表6 限饲对妊娠中期母羊肾周脂脂肪酸组成的影响 Table 6 Effects of feeding restriction on fatty acid composition of perirenal adipose tissue in mid⁃pregnancy dams 项目 对照组 Control group 限饲组 Restriction group P值 平均值 标准误 平均值 标准误 Items P⁃value Mean SE Mean SE 豆蔻酸 C14∶0 2.847 4 0.165 6 2.434 2 0.095 7 0.072 棕榈酸 C16∶0 24.306 1 0.479 1 25.151 4 0.392 9 0.219 棕榈油酸 C16∶1 1.468 5 0.072 3 1.298 4 0.068 3 0.123 十七烷酸 C17∶0 1.930 2 0.096 9 1.713 6 0.093 8 0.144 硬脂酸 C18∶0 38.837 5 1.593 0 40.042 8 0.836 3 0.556 反式油酸 C18∶1n9t 4.965 7 0.274 4 5.548 4 0.271 6 0.166 油酸 C18∶1n9c 20.933 6 0.806 9 20.225 6 0.532 4 0.511 亚油酸 C18∶2n6c 3.420 5 0.200 6 2.448 6 0.239 6 0.009 γ-亚麻酸 C18∶3n6 0.039 9 0.005 3 0.032 9 0.004 7 0.365 α-亚麻酸 C18∶3n6 0.179 8 0.067 1 0.199 7 0.065 6 0.840 花生酸 C20∶0 0.225 3 0.037 6 0.309 1 0.063 1 0.251 二十碳烯酸 C20∶1 0.548 6 0.060 0 0.418 6 0.075 6 0.197 二十碳三烯酸 C20∶3n6 0.033 4 0.002 4 0.024 3 0.002 7 0.026 花生四烯酸 C20∶4n6 0.195 2 0.011 6 0.107 1 0.021 6 0.002 二十二碳六烯酸 DHA 0.068 3 0.006 6 0.045 1 0.020 8 0.327 饱和脂肪酸 SFA 68.146 5 1.090 4 69.651 2 0.749 2 0.311 单不饱和脂肪酸 MUFA 27.916 3 0.982 1 27.491 1 0.566 9 0.715 多不饱和脂肪酸 PUFA 3.937 2 0.224 6 2.857 7 0.296 6 0.012 Table 7 Effects of feeding restriction on gene expressions related to lipid metabolism of omental adipose tissue in mid⁃pregnancy dams 对照组 Control group 限饲组 Restriction group 项目 平均值Mean 标准误SE P值 P⁃value Items 平均值 Mean 标准误SE 脂肪代谢 Lipid metabolism 乙酰辅酶A羧化酶α ACCα 1.086 0.186 1.020 0.197 0.814 酰基辅酶A氧化酶1 ACOX1 1.285 0.353 1.748 0.469 0.442 肉碱脂酰转移酶1A CPT1A 1.035 0.090 2.176 0.816 0.235 脂肪酸合成酶 FASN 1.086 0.157 0.798 0.231 0.309 激素敏感脂肪酶 HSL 1.230 0.292 1.556 0.364 0.496 肝X受体α LXRα 1.292 0.418 1.160 0.578 0.854 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α PGC⁃1α 1.360 0.397 0.654 0.248 0.222 过氧化物酶体增殖激活受体γ PPARγ 1.306 0.372 0.880 0.284 0.418 硬脂酰辅酶A脱氢酶1 SCD1 1.486 0.531 0.560 0.149 0.131 能量状态感知 Energy state perception 解偶联蛋白1 UCP1 1.197 0.282 0.515 0.171 0.124 解偶联蛋白2 UCP2 1.206 0.274 1.216 0.306 0.982 腺苷酸活化蛋白激酶的催化亚基α2 AMPKα2 1.061 0.090 1.690 0.297 0.066 腺苷酸活化蛋白激酶的非催化亚基β1 AMPKβ1 1.100 0.179 1.714 0.555 0.231 肝激酶B1 LKB1 1.200 0.287 1.268 0.082 0.875 由表8可知,与 C组相比,R组系膜脂脂肪酸 合成酶(FASN)、硬脂酰辅酶 A脱氢酶 1(SCD1)和解偶联蛋白 2(UCP2)基因表达有下调的趋势 (0.05≤P≤0.10),系膜脂过氧化物酶体增殖激活 受体 γ(PPARγ)基因表达有上调的趋势(0.05≤P≤0.10),其余系膜脂基因表达 2组间无显著差 异(P>0.10)。 Table 8 Effects of feeding restriction on gene expressions related to lipid metabolism of mesenteric adipose tissue in mid⁃pregnancy dams 对照组 Control group 限饲组 Restriction group P值 P⁃value 项目 平均值Mean 标准误SE Items 平均值 Mean 标准误SE 脂肪代谢 Lipid metabolism 乙酰辅酶A羧化酶α ACCα 1.349 0.328 0.775 0.181 0.247 酰基辅酶A氧化酶1 ACOX1 1.281 0.358 1.018 0.339 0.614 肉碱脂酰转移酶1A CPT1A 1.335 0.510 1.462 0.507 0.865 脂肪酸合成酶 FASN 1.617 0.586 0.463 0.146 0.099 激素敏感脂肪酶 HSL 1.123 0.233 1.800 0.536 0.209 肝X受体α LXRα 1.275 0.344 1.290 0.235 0.974 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α PGC⁃1α 1.260 0.416 1.517 0.762 0.754 过氧化物酶体增殖激活受体γ PPARγ 1.396 0.382 2.482 0.272 0.060 硬脂酰辅酶A脱氢酶1 SCD1 1.747 0.627 0.472 0.118 0.089 续表8 对照组 Control group 限饲组 Restriction group P值 P⁃value 项目 标准误 SE 平均值 Mean 标准误 SE Items 平均值 Mean 能量状态感知 Energy state perception 解偶联蛋白1 UCP1 1.143 0.256 1.372 0.285 0.561 解偶联蛋白2 UCP2 1.202 0.314 0.400 0.134 0.053 腺苷酸活化蛋白激酶的催化亚基α2 AMPKα2 1.234 0.222 1.283 0.287 0.893 腺苷酸活化蛋白激酶的非催化亚基β1 AMPKβ1 1.143 0.225 1.178 0.321 0.926 肝激酶B1 LKB1 1.082 0.186 3.015 1.458 0.277 由表 9可知,与 C组相比,R组肾周脂 FASN 和 UCP2基因表达显著下调(P<0.05);肾周脂腺 苷酸活化蛋白激酶的非催化亚基 β1(AMPKβ1)基 因表达显著上调(P<0.05),肾周脂肉碱脂酰转移 酶1A(CPT1A)基因表达有上调的趋势(0.05≤P≤0.10),其余肾周脂基因表达 2组间无显著差 异(P>0.10)。 Table 9 Effects of feeding restriction on gene expressions related to lipid metabolism of perirenal adipose tissue in mid⁃pregnancy dams 对照组 Control group 限饲组 Restriction group 项目 平均值 Mean P值 P⁃value Items 平均值 Mean 标准误 SE 标准误 SE 脂肪代谢 Lipid metabolism 乙酰辅酶A羧化酶α ACCα 1.110 0.218 0.770 0.230 0.314 酰基辅酶A氧化酶1 ACOX1 1.409 0.387 1.350 0.412 0.927 肉碱脂酰转移酶1A CPT1A 1.131 0.221 3.030 1.171 0.064 脂肪酸合成酶 FASN 1.212 0.297 0.268 0.062 0.024 激素敏感脂肪酶 HSL 1.277 0.359 1.144 0.240 0.785 肝X受体α LXRα 1.170 0.238 1.376 0.935 0.808 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α PGC⁃1α 1.157 0.304 0.535 0.226 0.177 过氧化物酶体增殖激活受体γ PPARγ 1.131 0.222 1.832 0.955 0.393 硬脂酰辅酶A脱氢酶1 SCD1 1.343 0.447 0.838 0.236 0.398 能量状态感知Energy state perception 解偶联蛋白1 UCP1 1.420 0.638 0.697 0.204 0.336 解偶联蛋白2 UCP2 1.053 0.152 0.504 0.088 0.016 腺苷酸活化蛋白激酶的催化亚基α2 AMPKα2 1.157 0.155 1.623 0.269 0.121 腺苷酸活化蛋白激酶的非催化亚基β1 AMPKβ1 1.143 0.187 1.986 0.332 0.035 肝激酶B1 LKB1 1.076 0.237 2.933 1.979 0.256 3 讨 论 饲粮营养供给不足时,妊娠母体会通过动员 自身的能量储备———脂肪组织来维持自身和妊娠 能量需求。 VAT作为机体能量贮存和脂肪代谢系 统的重要组成部分,可通过自身脂肪合成代谢和 分解代谢调控来影响血液中脂肪代谢物质的浓 度[12],进而影响机体脂肪代谢和能量代谢,以维持 机体脂肪代谢和能量代谢的相对平衡。 3.1 限饲对母羊血液生化指标的影响 胰高血糖素是机体能量代谢重要调节激素,其可通过促进糖异生和糖原分解,降低脂肪酸合 成和促进脂肪酸分解释放进入血液循环,以便机 体组织氧化供能等来维持机体血液 GLU和能量 稳衡[13]。胰高血糖素的升高会使机体从 VAT动 员分解更多的 FFA进入血液来弥补机体能量负平 衡[12]。 LEP和 ADP是脂肪组织分泌的调控脂肪 代谢、脂质稳态和能量代谢的重要调控因子[14-17],低营养条件和血液 FFA的增加都会抑制 LEP的 分泌[18],本试验中 R组母羊血液胰高血糖素和 FFA含量升高,血液 LEP和 ADP含量降低,血液 GLU含量相对稳定。这说明限饲条件下母体通过 升高血液胰高血糖素含量、降低 LEP和 ADP含量 来调整机体脂肪代谢,增强脂肪动员和增加对血 液中脂肪分解产物 FFA的利用来补偿机体能量不 足,以维持血液 GLU的相对稳定,从而适应营养 限制环境保证妊娠的进行,这与 Haghiac等[19]研 究结果一致。 3.2 限饲对母羊 VAT脂肪酸组成的影响 VAT脂肪酸组成主要受机体内脂肪合成代谢 和分解代谢影响,妊娠动物脂肪酸组成对其繁殖 性能、乳脂含量和能量代谢有重要意义。本试验 中,限饲引起 VAT脂肪酸组成发生明显变化,饱 和脂肪酸豆蔻酸和不饱和脂肪酸(C18和 C20为 主)在不同 VAT部位含量均降低。反刍动物中,中短链脂肪酸主要来自于乙酸和丁酸的从头合 成,PUFA主要来自于瘤胃微生物生物转化和饲粮 沉积[20-22]。这提示 R组 VAT脂肪酸变化的可能 原因如下:一方面来源下降,限饲造成脂肪酸合成 前体物乙酸和丁酸的来源减少,导致合成脂肪酸 的微生物减少[23],同时饲粮来源 PUFA也减少;另 一方面去路增加,饲粮供能不足导致妊娠母羊脂 肪动员,长链脂肪分解和脂肪酸氧化供能增加。 2方面共同作用,导致了 VAT脂肪酸组成的变化。 3.3 限饲对母羊 VAT脂肪代谢相关基因表达的 影响 机体营养状态可通过影响与脂肪代谢相关基 因的表达来调节脂肪组织脂肪合成、脂肪动员和 能量状态感知的功能[24],进而调控机体脂肪代谢 和能量代谢。本试验主要研究限饲对 VAT脂肪 合成、脂肪动员及能量状态感知关键基因表达的 影响。 FASN、SCD1、ACCa、肝 X受体 α(LXRα)和 PPARγ是参与脂肪从头合成、脂质储存、脂肪酸稳 态和脂肪细胞分化调控的关键基因[24-25],其中 FASN主要调控脂肪酸从头合成,影响脂肪沉 积[26-27];SCD1参与催化不饱和脂肪酸合成及饱和 脂肪酸去饱和化[28]。本试验中,与C组相比,R组 VAT中,FASN在肾周脂和系膜脂、SCD1在系膜 脂均不同程度下调,表明限饲引起的营养不足导 致肾周脂和系膜脂中长链脂肪酸从头合成能力减 弱。 VAT亚油酸、α-亚麻酸、二十碳烯酸等脂肪 酸含量降低印证了基因表达的结果。 激素敏感脂肪酶(HSL)、CPT1A、酰基辅酶 A 氧化酶1(ACOX1)和过氧化物酶体增殖物激活受 体 γ共激活因子 1α(PGC⁃1α)是调控脂肪动员、脂肪酸氧化、细胞脂质摄取及分解和线粒体合成 及产能的关键调控基因[29-31],尤其 CPT1A是长链 脂肪酸 β氧化早期步骤的关键调控因子,参与调 节组织中脂肪酸氧化速率[32-33]。本试验中,R组 VAT,肾周脂 CPT1A有上调趋势,表明肾周脂中 长链脂肪酸氧化速率加快,这与肾周脂长链脂肪 酸含量降低的结果一致,提示母体可能通过此途 径来补偿营养限制造成的机体能量短缺。 AMPK通路能感应机体能量需求状况,调节 机体产能和耗能代谢,被称为细胞“代谢感受器”和“能量总开关”,是 GLU代谢、脂质代谢和脂肪 酸组成的中心调控因子[24],其还能与肝激酶 B1(LKB1)互作维持脂质和能量平衡[34]。通路中 AMPKα2和 AMPKβ1分别编码 α2和 β1催化亚 基。本试验中,R组 VAT中,肾周脂 AMPKβ1基 因表达上调,网膜脂 AMPKα2基因表达有上调趋 势,表明限饲促进肾周脂和网膜脂能量感知开关 基因的表达。解偶联蛋白(UCP)家族与机体能量 代谢平衡、脂肪沉积、产热等密切相关,其中解偶 联蛋白1(UCP1)主要调控棕色脂肪组织非颤抖性 产热;UCP2主要通过上调解偶联作用来调控基础 能量代谢,其还能影响 FASN基因表达来调节脂质 合成[35-36]。本试验中,R组 VAT中,UCP2基因 在肾周脂表达下调,在系膜脂也有下调的趋势,提 示限饲使母体基础能量代谢水平趋于下降,有利 于机体适应限饲引起的能量不足,这可以理解为 母体适应外界不良环境的一种自我保护。 De Queiroz等[37]研究表明,UCP2基因表达与脂肪组 织脂肪酸含量呈正相关,脂肪 FASN和 UCP2基因 表达变化也有同步性[35]。本试验 UCP2、FASN基 因表达变化及脂肪酸含量变化与上述研究结果一 致。综上所述,限饲上调了母体 VAT能量感知开 关,并使母体的基础能量代谢水平有降低的趋势。 此外,本试验发现网膜脂和肾周脂脂肪酸组 成受限饲影响程度大于系膜脂;限饲对肾周脂脂 肪代谢基因表达的影响程度明显大于网膜脂和系 膜脂。这提示不同 VAT部位对限饲的响应强度 存在差异性,从强到弱依次为肾周脂、网膜脂和系 膜脂,推测这可能与饥饿-下丘脑-肾上腺轴对营 养限制的快速感知和响应路径有关,具体原因有 待深入研究。 4 结 论 妊娠中期限饲导致母羊血液中脂肪代谢调控 因子(LEP和 ADP)含量下降,脂肪代谢产物 (FFA)含量上升;VAT脂肪酸组成改变(PUFA下 降);并经下调脂肪合成基因(FASN和 SCD1)、上 调脂肪动员基因(CPT1A)及下调基础能量代谢基 因(UCP2)表达的途径,使母体 VAT脂肪合成作 用减弱、脂质分解和脂肪酸氧化增强来调节机体 能量稳态。 参考文献: [ 1] GUZMÁN C,CABRERA R,CÁRDENAS M, et al.Protein restriction during fetal and neonatal develop⁃ment in the ratalters reproductive function and accel⁃eratesreproductive ageing in female progeny[ J] .Jour⁃nal of Physiology,2006,572(1):97-108. 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Effects of Feeding Restriction on Blood Biochemical Indexes and Lipid Metabolism of Visceral Adipose Tissue in Mid⁃Pregnancy Dams YANG Hong1,2 ZHOU Xiaoling1,2,3 YAN Qiongxian1,4∗ TAN Zhiliang1,5 (1. Key Laboratory of Agro⁃Ecological Processesin Subtropical Region, National Engineering Laboratory for Pollution Control and Waste Utilization in Livestock and Poultry Production,Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Hunan Provincial Engineering Research Center for Healthy Livestock and Poultry Production,Scientific Observing and Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in South⁃Central, Ministry of Agriculture, Changsha 410125, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3. College of Animal Science, Tarim University, Alaer 843300, China; 4. Hunan Co⁃Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 5. Hunan CoInnovation Center of Animal Production Safety, Changsha 410128, China) Abstract: This experiment was conducted to investigate the effects of feeding restriction on blood biochemical in⁃dexes, fatty acid composition and gene expressions related to lipid metabolism of visceral adipose tissue (VAT) in mid⁃pregnancy ewes. Sixteen Xiangdong black goats [gestation time of (45±3) d], body weight of (29.86±3.07) kg] were chosen and randomly assigned to control group (C group,100% of pregnancy nutritional require⁃ments)and restricted group (R group,40% of pregnancy nutritional requirements), and each group comprised of 8 dams. The experiment period was 45 to 100 d of gestation. At day 101 of gestation, blood biochemical indexes,fatty acid composition and gene expressions related to lipid metabolism and energy sensing in omental, mesenteric and perirenal adipose tissues were detected. The resultsshowed that R group compared with C group: 1) blood contents of glucagon and free fatty acid were significantly increased (P<0.05), and blood contents of leptin, adi⁃ponectin and high⁃density lipoprotein cholesterol were significantly decreased (P<0.05). 2) The contents of arachi⁃donic acid (C20∶4n6),palmitoleic acid (C16∶1), linoleic acid (C18∶2n6c), epoxyeicosatrienoic acids (C20∶3n6)and polyunsaturated fatty acid (PUFA)in omental adipose tissue were significantly decreased (P<0.05); the con⁃tent of myristic acid in mesenteric adipose tissue was significantly decreased (P<0.05); the contents of linoleic acid, arachidonic acid, epoxyeicosatrienoic acids and PUFA in perirenal adipose tissue were significantly decreased (P<0.05). 3) The expression of adenosine 5′⁃monophosphate⁃activated protein kinase α 2 (AMPKα2) gene in omental adipose tissue tended to be increased (0.05≤P≤0.10); the expressions of fatty acid synthetase (FASN),stearoyl⁃CoA desaturase⁃1 (SCD1) and uncoupling protein 2 (UCP2) genes in mesenteric adipose tissue tended to be decreased (0.05≤P≤0.10), and the expression of peroxisome proliferator⁃activated receptor γ (PPARγ) gene tended to be increased (0.05≤P≤0.10);in perirenal adipose tissue,the expressions of FASNand UCP2 genes were significantly decreased (P<0.05), while that of adenosine 5′⁃monophosphate⁃activated protein kinase β1(AMPKβ1) gene was significantly increased (P<0.05), and that of carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A)gene tended to be increased (0.05≤P≤0.10). These results indicate that feeding restriction during mid⁃gestation decreases contents of lipid metabolism regulator factors (leptin and adiponectin), increases contents of lipid metab⁃olites ( free fatty acids), and affects fatty acid composition (decreases PUFA content), down⁃regulates gene (FASN and SCD1) expressions related to lipid synthesis, up⁃regulates gene (CPT1A) expression related to lipid mobilization, and down⁃regulates gene (UCP2) expression related to basal energy metabolism in VAT of dams,thereby attenuates lipid anabolism and enhances lipid mobilization in VAT to regulate body energy balance.[Chi⁃nese Journal of Animal Nutrition,2018,30(6):2182⁃2193] Key words: feeding restriction; mid⁃gestation;fatty acids;lipid metabolism; goat
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