玉米秸秆和水稻秸秆中粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维以及蛋白质含量含量的检测

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检测样品: 饲料
检测项目: 营养成分
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发布时间: 2023-09-16
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植物乳杆菌对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵特性的影响

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植物乳杆菌对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵特性的影响动物营养学报2017,29(2):678⁃689Chinese Journal of Animal Nutritiondoi:10.3969/ j.issn.1006⁃267x.2017.02.038 陈 亮等:植物乳杆菌对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵特性的影响2期976 植物乳杆菌对玉米秸秆和水稻秸秆 体外发酵特性的影响 陈 亮 1,2 任 傲 1,2∗ 李 斌 3 周传社 2,4∗∗ 谭支良 2 (1.湖南农业大学动物科学技术学院 ,长沙 410128;2.中国科学院亚热带农业生态研究所 ,亚热带农业生态 过程重点实验室 ,湖南省畜禽健康养殖工程技术中心 ,农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站 ,长沙 410125;3.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所 ,拉萨 850000; 4.湖南畜禽安全生产协同创新中心 ,长沙 410128) 摘 要 :本试验旨在探讨植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum )对玉米秸秆和水稻秸秆奶牛瘤胃 体外发酵特性的影响 。采用单因子随机区组试验设计 ,分别以玉米秸秆和水稻秸秆为发酵底 物 ,分析不同添加水平 [0(对照 )、0.25×107、0.50×107和 0.75×107 CFU/mL ]植物乳杆菌对发酵 底物体外发酵产气量 (1、2、4、6、12、24、36、48 h )、产气参数 、干物质降解率 (DMD )、中性洗涤纤 维降解率 (NDFD )、发酵液挥发性脂肪酸 (VFA )、氨态氮 (NH3⁃N )浓度及 pH 的影响 。结果表 明 :添加植物乳杆菌能显著提高玉米秸秆发酵初期产气速率和产气量 (1~24 h )(P <0.05),以添 加 0.75×107 CFU/mL 效果最为理想 ;添加植物乳杆菌能显著提高水稻秸秆体外发酵后期 (36~48 h )产气量 (P <0.05),而以添加 0.25×107 CFU/mL 效果最为理想 。随着植物乳杆菌添加水平 的增加 ,2种底物体外发酵液 NH3⁃N 浓度均呈现显著的线性增加效应 (P <0.05)。不同植物乳 杆菌添加水平对 2种底物体外发酵 NDFD 、DMD 、发酵液 VFA (乙酸 、丙酸 、异丁酸 、丁酸和戊 酸 )浓度以及 pH 均无显著影响 (P >0.05)。由试验结果推断 ,添加植物乳杆菌能促进玉米秸秆 和水稻秸秆体外发酵及其氮代谢 ,同时对维持 pH 的稳定平衡具有积极作用 ,最佳添加水平分别 为 0.75×107和 0.25×107CFU/mL 。 关键词 :植物乳杆菌 ;体外发酵 ;瘤胃 ;奶牛 ;玉米秸秆 ;水稻秸秆 中图分类号 :S816.7;S823 文献标识码 :A 文章编号 :1006⁃267X (2017)02⁃0678⁃12 随着人们对畜牧产品安全和环境保护意识的 不断加强 ,微生态制剂作为一种绿色 、安全 、高效 的饲料添加剂倍受关注 ,越来越多地应用于畜禽 养殖中 。目前 ,微生态制剂研究较多的菌种大致 分为乳酸菌类 、真菌及酵母菌类 、芽孢杆菌类 、光 合细菌类 [1],在反刍动物营养与饲料中 ,应用较广 泛的是乳酸菌 、酵母菌以及芽孢杆菌 [2],而乳酸菌 更多地被用于青贮饲料的发酵 [3-5]。植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum )作为乳酸菌的一种 ,目前 普遍应用于对青贮饲料的发酵 。 Contreras⁃Govea 等 [6-7]利用植物乳杆菌对苜蓿和玉米植株进行青 贮发酵 ,发现植物乳杆菌能显著促进青贮饲料中 微生物生长 ;利用植物乳杆菌对青贮玉米进行发 酵 ,结果表明 ,植物乳杆菌能促进发酵的进行和青 贮玉米饲料的有氧稳定性 [8-9],但也有学者研究报 道植物乳杆菌对青贮玉米饲料发酵的有氧稳定性 没有显著影响 [10-11]。 目前 ,玉米秸秆和水稻秸秆是我国主要农业 收稿日期 :2016-08-22 基金项目 :娟姗牛生产性能与乳品质提升营养调控关键技术研究 (西藏自治区财政专项 );国家 “十二五 ”科技支撑计划 (2012BAD14B17); 国家自然科学基金 (31001024);中国科学院亚热带农业生态研究所青年人才领域项目 (ISACX⁃LYQY⁃QN⁃1105) 作者简介 :陈 亮 (1987—),男 ,安徽阜阳人 ,硕士 ,研究方向反刍动物营养学 。 E⁃mail : chenliang071110@163.com ∗同等贡献作者 作物秸秆 ,在我国每年的作物秸秆总产量中占很 大比例 ,而秸秆养畜对提高秸秆利用率具有重要 意义 。与牧草相比 ,玉米秸秆和水稻秸秆品质较 低 ,秸秆饲料加工成为提高秸秆饲喂价值的重要 手段 ,国内外专家对各种添加剂在秸秆养畜中的 作用进行了大量研究 ,而对添加植物乳杆菌是否 能提高玉米秸秆和水稻秸秆体外瘤胃发酵特性鲜 有报道 。 本试验利用体外发酵实时监测技术 ,以植物 乳杆菌为试验菌株 ,以玉米秸秆和水稻秸秆为发 酵底物 ,研究其对奶牛瘤胃体外发酵特性的影响 ,为进一步研究其在奶牛生产中的实际应用提供理 论依据和技术支撑 。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验菌株 植物乳杆菌 ,经真空冷冻干燥保存于安瓿管 ,购买于中国工业微生物菌种保藏中心 ,菌种号 :22696。 1.1.2 MRS 培养基 酪蛋白胨 10.0 g 、牛肉膏 10.0 g 、酵母粉 5.0 g 、葡 萄糖 5.0 g 、乙酸钠 5.0 g 、柠檬酸二铵 2.0 g 、Tween 801. 0 g 、 K2HPO42. 0 g 、 MgSO4· 7H2O 0.2 g 、MnSO4·H2O 0.05 g 、CaCO20.0 g 、琼脂 15.0 g ,用蒸 3馏水溶解定容至 1.0 L ,调整 pH 为 6.8。 1.1.3 缓冲液 按照 Menke 等 [12]的方法配制瘤胃体外发酵 厌氧缓冲液 。 1.1.4 发酵底物 本试验采用玉米秸秆 (湖南长沙科湘甜玉 1号 )与水稻秸秆 (湖南浏阳湘 125s )作为发酵底 物 。 2种秸秆经 65 ℃烘干 24 h ,粉碎过 1 mm 孔 径筛后备用 。底物粗纤维含量按照 GB/T 18868—2002方法测定 ;依照 Hall 等 [13]的方法 ,使 用 Fibretherm FT12全自动纤维仪 (Gerhardt Ana⁃lytical Systems ,德国 )测定中性洗涤纤维 (neutral detergent fiber ,NDF )和酸性洗涤纤维 ( acid deter⁃gent fiber ,ADF )含量 ;按照杨胜 [14]确定的常规方 法测定干物质 (DM )、有机物 (OM )、粗蛋白质 (CP )、中性洗涤可溶物 (NDS )含量 。玉米秸秆和 水稻秸秆主要营养成分含量见表 1。 表 1 玉米秸秆和水稻秸秆主要营养成分含量 (干物质基础 ) Table 1 Main nutrient composition contents of maize stover and rice straw (DM basis ) [15] % 项目 含量 Content Items 玉米秸秆 Maize stover 水稻秸秆 Rice straw 干物质 DM 95.40 94.38 有机物 OM 75.86 72.21 粗蛋白质 CP 5.23 6.24 中性洗涤纤维 NDF 63.59 63.15 酸性洗涤纤维 ADF 38.56 43.37 粗纤维 CF 31.15 33.05 中性洗涤可溶物 NDS 26.41 26.85 1.1.5 试验动物及饲粮 本试验供体奶牛为健康状况良好 、体重 [(500±50) kg ]相近的 3头装有永久瘤胃瘘管的 荷斯坦奶牛 (Holstein cow ),试验奶牛由湖南省长 沙市望城县白若铺镇胜和奶牛养殖基地提供 。试 验期间 ,奶牛饲粮参照 NRC (2001)标准配制 。基 础饲粮由粗料 (水稻秸秆 )和精料组成 ,饲粮精粗 比为 60∶40。基础饲粮营养成分水平测定方法与 底物相同 ;利用电感耦合等离子体原子发射光谱 法 ( ICP⁃AES )法测定钙 (Ca )、磷 (P )含量 [16]。基 础饲粮组成及营养水平见表 2。 1.2 方法 1.2.1 试验设计 本试验采取单因子随机区组试验设计 ,植物乳杆 菌 (Lactobacillus plantarum )设置 4个添加水平 [0(对 照 )、0.25×107、0.50×107、0.75×107 CFU/mL ],每个添 加水平设置 12、24、48 h 3个采样时间点 ,每个采样时 间点设置 3个样品重复 。 表 2 基础饲粮组成及营养水平 (干物质基础 ) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis ) [15] % 项目Items 含量 Content 原料Ingredients 水稻秸秆 Rice straw 40.00 玉米 Corn 39.60 豆粕 Soybean meal 18.10 磷酸氢钙 CaHPO4 1.00 石粉 Limestone 0.30 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 干物质 DM 70.88 粗蛋白质 CP 17.98 酸性洗涤纤维 ADF 42.98 中性洗涤纤维 NDF 23.72 钙 Ca 0.72 磷 P 0.35 泌乳净能 NEL /(MJ/kg) 7.70 1)每千克预混料含有以下成分 One kg of premix pro⁃vided the following :VA ≥2 000 000 IU ,VD ≥300 000 IU ,VE ≥3 000 IU ,Cu ≥3 500 mg ,Fe ≥10 000 mg ,Zn ≥10 000 mg ,Mn ≥9 000 mg ,Mg ≥9 800 mg ,I ≥90 mg ,Se ≥40 mg ,Co ≥30 mg 。 2)泌乳净能根据刘玉杰等 [17]的方法计算 ,其他营养水 平为测定值 。 NEL was calculated according to the method of Liu ,etal [17], whilethe other nutrient levels were measured values. 1.2.2 菌株培养 将保存有菌株的安瓿管管口一端于酒精灯火 焰上灼烧 ,然后滴 1~2滴无菌水 ,轻轻敲打使其管 口破碎 ,向安瓿管中加入 0.5~1.0 mL 已灭菌无琼 脂液体 MRS 培养基 ,使固体菌株完全溶解后 ,利 用无菌 1 mL 注射器转入到装有 20 mL 液体 MRS 培养基的 50 mL 锥形瓶中 ,37 ℃静止培养 48 h 后 ,进行连续传代培养 ,至第 4代时 ,对其进行平 板涂布计数 。试验所需菌株浓度为 1 ×107 CFU/mL 时 ,培养瓶转移至 4 ℃冰箱保存待 用 。菌株活化 、传代以及平板计数过程均在无菌 条件下进行 。 1.2.3 体外发酵液配制 于晨饲前采集 3头瘘管牛瘤胃食糜 ,用 8层纱 布过滤 ,滤液等体积混合后装入事先充满 CO2并 预热到 39.5 ℃的保温瓶中 ,迅速带回实验室 ,与事 先在 39.5 ℃恒温水浴锅中预热的厌氧缓冲液混合 (缓冲液 ∶瘤胃液 =9∶1,体积比 ),并持续通入 CO2。 1.2.4 体外培养 本试验中所用培养设备为自主研发体外发酵 设备 ,由恒温摇床培养箱 (6×6格 )、电脑主机 、显 示器等硬件设备组成 。其中恒温摇床培养箱每格 为 1个单元 ,体外发酵时 ,放置 1个发酵瓶 ;每格 均对应 1个空气压力传感器与发酵瓶相连 ,空气 压力传感器与电脑主机相连 ,实时监控发酵瓶内 气压变化 。称取 (0.500 0±0.000 3) g 发酵底物于 发酵瓶中 ,按试验设计分别向发酵瓶中加入 0、0.25、0.50、0.75 mL 菌液 。将上述准备好的发酵 瓶置于 39.5 ℃恒温培养箱中预热 ,向发酵瓶中通 入 CO2,随后加入 50 mL 发酵液 ,并持续通入 CO2,立即加上瓶塞瓶盖 ,并使用针头放气 ,使内外 压强保持一致 ,然后迅速放回恒温培养箱 ,39.5 ℃恒温培养 48 h 。 1.2.5 体外发酵总产气量测定 分别于体外发酵中的 1、2、4、6、12、24、36、48 h 使用压力传感器 (CYG130-12,昆山双桥传感 器测控技术有限公司 )测定发酵瓶内的气压 ,并按 公式 y =1.506x 将气压换算成为室温标准气压下 的气体体积 。其中 1.506为实测压强与体积之间 的换算系数 ,x 为实测压强 ,y 为产气量 。 利用 Wang 等 [18]提出的 LE 模型对累积产气 量数据进行拟合 : ; 式中 :V 为 t 时间点底物的产气量 (mL );Vf 为 理论最大产气量 (mL );k 为产气分率 (% /h );b 和 d 为曲线的形状指标 ,b >0表示曲线为 S 形 ,b <0则表示曲线非 S 形 。下式同 。 利用下列公式计算发酵初期产气速率 (FRD0 ) (<12 h ); 利用下列公式计算达 1/2理论最大产气量的 时间 ( t 0 . 5)[19]。 1.2.6 体外发酵干物质降解率 (DMD )、中性洗涤 纤维降解率 (NDFD )及发酵液氨态氮 (NH3⁃N )和 挥发性脂肪酸 (VFA )浓度 、pH 测定 分别于体外发酵 12、24、48 h 时取出发酵瓶 , 发酵液经 400目尼龙布过滤 ,利用 pH 计 (REX PHS-3C ,上海仪器设备厂 )立即测定滤液 pH ;随 后将滤液分装到离心管中 ,用于 NH3⁃N 、VFA 浓度 测定 。按照冯宗慈等 [20]改进的比色法测定 NH3⁃N 浓度 ;按照 Vanzant 等 [21]提供的方法测定 VFA 浓 度 。将过滤后的残渣全部转移至石英坩埚中并用 热蒸馏水反复冲洗 ,置于 105 ℃烘箱中烘干 8 h 以 测定剩余干物质含量 ,并计算其 DMD ;测定过 DMD 后的残渣回收用样品袋密封保存 ,用于 NDFD 的测定 [13]。 1.3 数据分析 试验数据采用 SAS 8.2的 MIXED 过程统计 ,不同添加水平间的差异采用 contrast 语句进行比 较 。统计差异显著性定义为 P <0.05。 2 结 果 2.1 植物乳杆菌不同添加水平对体外发酵产气量的 影响 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆体外发 酵产气量的影响如表 3所示 。当以玉米秸秆为发 酵底物时 ,发酵前期 (1、2和 4 h )添加 0.75×107 CFU/mL 植物乳杆菌体外发酵产气量均显著 高于对照组 、0.25×107和 0.50×107 CFU/mL 添加 组 (P <0.05),而后 3组之间差异不显著 (P >0.05);发酵 6 h 时 ,添加 0.75×107 CFU/mL 植物 乳杆菌体外发酵产气量显著高于 0. 50 ×107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),而与对照组和 0.25×107 CFU/mL 添加组没有显著差异 (P >0.05);发酵 12 h 时 ,添加 0.75×107 CFU/mL 植物 乳杆菌体外发酵产气量均显著高于对照组 、0.25×107和 0.50×107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),且 0.50×107 CFU/mL 添加组亦显著高于对照组和 0.25×107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),而后 2组之 间差异不显著 (P >0.05);在发酵 24 h 时 ,添加 0.75×107和 0.50×107 CFU/mL 植物乳杆菌体外 发酵产气量均显著高于对照组和 0. 25 ×107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),而 0.75×107和 0.50×107 CFU/mL 添加组之间 、对照组和 0.25×107 CFU/mL 添加组之间均没有显著差异 (P >0.05);而在发酵 36和 48 h 时 ,各组之间体外发酵 产气量均无显著差异 (P >0.05)。由此可知 ,在以 玉米秸秆为底物的体外发酵过程中 ,添加植物乳 杆菌能显著促进体外发酵前期的进行 ,同时以植 物乳杆菌添加量为 0.75×107 CFU/mL 时 ,效果 最强 。 当以水稻秸秆为发酵底物时 ,在发酵 1 h 时 ,对照组体外发酵产气量均显著高于其他 3组 (P <0.05),且添加 0.25×107 CFU/mL 植物乳杆菌时 ,显著高于 0.75×107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),而 与 0.50×107 CFU/mL 添加组没有显著差异 (P >0.05)。这可能由于植物乳杆菌在发酵刚开始存 在一定适应性 ,一定程度上抑制了发酵初期的正 常进行 。在发酵 36和 48 h 时 ,添加 0. 25 ×107 CFU/mL 植物乳杆菌时体外发酵产气量均显 著高于对照组和 0.75×107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),而与 0.50×107 CFU/mL 添加组没有显著差 异 (P >0. 05);且对照组 、0. 50 ×107和 0. 75 ×107 CFU/mL 添加组之间体外发酵产气量差异不 显著 (P >0.05)。 2.2 植物乳杆菌不同添加水平对体外发酵产气 参数的影响 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆体外发 酵产气参数的影响如表 4所示 。玉米秸秆理论最 大产气量 、发酵初期产气速率和达 1/2理论最大 产气量的时间各添加水平的平均值均显著高于水 稻秸秆 (P <0.05)。 当以玉米秸秆为底物时 ,添加 0. 75 ×107 CFU/mL 植物乳杆菌发酵初期产气速率显著 高于对照组 、0.25×107和 0.50×107 CFU/mL 添加 组 (P <0.05),且 0.50×107 CFU/mL 添加组发酵初 期产气速率亦显著高于对照组 (P <0.05),而与 0.25×107 CFU/mL 添加组之间差异不显著 (P >0.05),且 0.25×107 CFU/mL 添加组与对照组之间 差异亦不显著 (P >0.05)。添加 0.75×107 CFU/mL 植物乳杆菌体外达 1/2理论最大产气量的时间显 著低于对照组和 0.25×107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),而与 0.50×107 CFU/mL 添加组之间差异不 显著 (P >0.05);而 0.50×107 CFU/mL 添加组与对 照组 、0.25×107 CFU/mL 添加组之间差异不显著 (P >0.05)。不同添加水平植物乳杆菌对理论最大 产气量均没有显著影响 (P >0.05)。 当以水稻秸秆为发酵底物时 ,不同添加水平 植物乳杆菌对理论最大产气量和达 1/2理论最大 产气量的时间均没有显著影响 (P >0.05);添加 0.75×107 CFU/mL 植物乳杆菌发酵初期产气速率 显著高于对照组 (P <0.05)。随着植物乳杆菌添加 水平的增加 ,发酵初期产气速率呈显著的线性增 加效应 (P <0.05)。对发酵初期产气速率 ,发酵底 物和植物乳杆菌添加水平之间呈显著的交互效应 (P <0.05),而对理论最大产气量和达 1/2理论最 大产气量的时间则没有显著的交互效应 (P >0.05)。 表 3 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵产气量的影响 Table 3 Effects of different supplemental levels of Lactobacillus plantarum on in vitro fermentation gas production of maize stover and rice straw mL 底物 水平 Levels / 产气量 Gas production Substrates (×107 1 h 2 h 4 h 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h CFU/mL) 0 6.98 10.54 14.81 19.53 33.83 59.29 74.30 78.76 ±0.46b ±0.39b ±0.61b ±0.91a ±0.57c ±0.38b ±0.92 ±1.09 6.78 10.99 15.51 20.18 33.73 58.88 73.59 78.36 玉米秸秆 0.25 ±0.66b ±0.69b ±0.54b ±0.54ab ±0.84c ±1.14b ±1.40 ±1.37 Maize stover 7.18 10.99 16.47 21.69 36.14 61.29 75.75 80.27 0.50 ±0.88b ±0.94b ±1.28b ±1.57b ±1.31b ±1.48a ±1.92 ±2.49 0.75 11.85 16.77 22.99 28.61 40.16 62.85 75.25 79.32 ±1.00a ±1.06a ±1.37a ±0.99a ±0.61a ±0.61a ±2.74 ±2.59 0 10.84 12.65 15.31 17.72 27.26 50.80 64.91 70.63 ±0.15a ±0.26 ±0.17 ±0.31 ±0.84 ±1.66 ±1.71b ±1.83b 0.25 9.69 15.81 15.81 18.83 27.56 52.11 67.32 73.64 水稻秸秆 ±0.53b ±0.53 ±0.69 ±0.78 ±0.79 ±1.31 ±1.20a ±0.94a Rice straw 0.50 8.99 11.80 15.11 18.02 26.96 51.30 65.81 71.99 ±0.53bc ±0.43 ±0.83 ±0.77 ±0.92 ±0.74 ±0.45ab ±0.45ab 0.75 8.63 12.10 15.76 18.67 26.81 50.75 64.91 70.98 ±0.74c ±0.74 ±0.83 ±1.34 ±1.85 ±1.31 ±0.66b ±0.96b 同列数据肩标不同字母 ( a~ c )表示不同植物乳杆菌添加水平间差异显著 (P <0.05)。 Values within a column with different letter superscripts ( ato c ) differed significantly among Lactobacillus plantarum sup⁃plementation levels (P <0.05) . 表 4 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵产气参数的影响 Table 4 Effects of different supplemental levels of Lactobacillus plantarum on in vitro fermentation gas production parameters of maize stover and rice straw 水平 Levels /(×107 CFU/mL) P值 P⁃values 项目 底物 平均值 SEM 底物 Substrate 水平 Level 交互效应 Interaction Items Substrates Mean 0 0.25 0.50 0.75 理论最大产气量 Theoretical maximum GP/mL 玉米秸秆 Maize stover 83.56e 82.22 82.34 84.53 85.17 1.27 <0.000 1 0.512 1 0.207 8 水稻秸秆 Rice straw 74.82f 72.84 76.98 75.04 74.42 0.065 3 SEM4) 0.64 发酵初期产气速率 玉米秸秆 Maize stover 3.18e 2.68c 2.83bc 3.18b 4.03a 0.09 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 Initial GP rate of fermentation/ (×10-2 mL/h) 水稻秸秆 Rice straw 1.71f 1.55b 1.69ab 1.74ab 1.86a L(<0.000 1) SEM4) 0.05 续表 4 水平 Levels /(×107 CFU/mL) P值 P⁃values 项目 底物 平均值 SEM 底物Substrate 水平Level 交互效应Interaction Items Substrates Mean 0 0.25 0.50 0.75 玉米秸秆 15.63e 16.13a 16.18a15.44ab14.76b 0.29 <0.000 1 0.032 5 0.179 1 达1/2理论最大产气量的时间 Maize stover Time of reaching 1/2 theoretical maximum GP /h 水稻秸秆 Rice straw 19.17f 19.12 19.42 19.10 19.05 0.898 7 SEM4) 0.15 1)植物乳杆菌不同添加水平之间的平均值 ;2)发酵底物与添加水平之间交互效应的标准误 ;3)L 表示添加水平的线性效 应 ;4)不同添加水平合并平均值的标准误 。下表同 。 1)mean for individual Lactobacillus plantarum across supplementation levels ;2) SEM for the interaction of supplementation level and substrate ;3) L meant linear effect of supplementation level ;4) SEM for pooled mean of Lactobacillus plantarum supple⁃mentation levels. The same as below. 同列数据肩标不同字母 ( e 、f )表示发酵底物间差异显著 (P <0.05);同行数据肩标不同字母 ( a~ c )表示植物乳杆菌添加 水平间差异显著 (P <0.05)。下表同 。 Values within a column with different letter superscripts ( eand f ) differed significantly between substrates (P <0.05); val⁃ues within a row with different letter superscripts ( a to c ) differed significantly among Lactobacillus plantarum supplementation levels (P <0.05) . The same as below. 2.3 植物乳杆菌不同添加水平对体外发酵 VFA 浓度的影响 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻 秸秆体外发酵 VFA 浓度的影响如表 5所示 。玉米 秸秆为发酵底物时 ,体外发酵各 VFA 浓度和乙酸 /丙酸各植物乳杆菌添加水平的平均值均显著高于 水稻秸秆 (P <0.05)。 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻 秸秆体外发酵乙酸 、丙酸 、异丁酸 、丁酸 、戊酸和总 VFA 浓度及乙酸 /丙酸均没有显著影响 (P >0.05),且植物乳杆菌添加水平与发酵底物间的没 有显著交互效应 (P >0.05)。 表 5 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵 48 h VFA 浓度的影响 Table 5 Effects of different supplemental levels of Lactobacillus plantarum on VFA concentrations of 48 h in vitro fermentation of maize stover and rice straw 水平 Levels /(×107 CFU/mL) P值 P⁃values3) 项目 发酵底物 平均值 SEM2) 底物 Substrate 水平 Level 交互效应 Interaction Items Substrates Mean1) 0 0.25 0.50 0.75 乙酸 玉米秸秆 Maize stover 22.79e 19.75 23.36 23.92 24.16 2.32 <0.000 1 0.709 3 0.834 4 Acetic acid/ 水稻秸秆 Rice straw 14.64f 14.11 13.94 16.89 14.42 0.859 3 (mmol/L) SEM 1.20 玉米秸秆 Maize stover 5.82e 5.04 6.08 5.86 6.29 0.61 0.000 6 0.603 8 0.672 5 丙酸 水稻秸秆 Propionic acid/(mmol/L) 4.18f 4.09 3.88 4.63 4.12 0.798 2 Rice straw SEM 0.31 续表 5 水平 Levels /(×107 CFU/mL) P值 P⁃values3) 项目 发酵底物 平均值 SEM2) 底物 水平 交互效应 Items Substrates Mean1) 0 0.25 0.50 0.75 Substrate Level Interaction 异丁酸 玉米秸秆 Maize stover 30.21e 26.43 30.36 30.69 33.36 3.09 0.000 8 0.570 9 0.277 9 Isobutyric acid/ (×10-2 mmol/L) 水稻秸秆 Rice straw 23.95f 26.66 21.89 25.40 21.83 0.486 3 SEM 1.57 玉米秸秆 Maize stover 1.86e 1.64 1.95 1.87 1.96 0.18 <0.000 1 0.694 8 0.490 0 丁酸 Butyric acid/(mmol/L) 水稻秸秆 Rice straw 1.23f 1.29 1.14 1.36 1.14 0.566 0 SEM 0.08 异戊酸 玉米秸秆 Maize stover 43.71e 35.84 42.78 45.30 50.92, 4.99 0.000 3 0.389 1 0.507 9 Isovalaric (×10-2 mmol/L) acid/ 水稻秸秆 Rice straw 32.40f 32.27 29.13 35.83 32.37 0.632 9 SEM 2.54 戊酸 Valeric acid/(×10-2 mmol/L) 玉米秸秆 Maize stover 33.47e 25.76c31.74bc35.49b 40.90a 2.77 <0.000 1 L(0.000 8) 0.071 1 水稻秸秆 Rice straw 24.94f 24.64 22.20 28.06 24.87 0.577 1 SEM 1.39 乙酸 /丙酸 玉米秸秆 Maize stover 3.62e 3.64 3.63 3.60 3.61 0.04 <0.000 1 0.421 1 0.520 9 Acetic acid/ propionic acid 水稻秸秆 3.49f 3.46 3.49 3.51 3.53 0.805 9 Rice straw SEM 0.02 玉米秸秆 Maize stover 27.53e 22.29 29.84 27.02 30.97 3.95 0.000 4 0.602 5 0.482 4 总挥发性脂肪酸 TVFA 水稻秸秆 Rice straw 18.99f 20.36 17.13 20.47 17.99 0.833 0 SEM 2.04 2.4 植物乳杆菌不同添加水平对体外发酵 NDFD 和 DMD 的影响 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻 秸秆体外发酵 NDFD 和 DMD 的影响如表 6所示 。玉米秸秆和水稻秸秆不同植物乳杆菌添加水平的 NDFD 和 DMD 平均值均无显著差异 (P >0.05)。植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻秸秆 两种发酵底物体外发酵 NDFD 和 DMD 亦没有显 著影响 (P >0.05),且对这 2个指标 ,发酵底物和植 物乳杆菌添加水平之间没有显著的交互效应 (P >0.05)。 2.5 植物乳杆菌不同添加水平对体外发酵 NH3⁃N 浓度和 pH 的影响 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻 秸秆体外发酵 NH3⁃N 浓度和 pH 的影响如表 7所 示 。随着植物乳杆菌添加水平的增加 ,玉米秸秆 和水稻秸秆体外发酵 NH3⁃N 浓度均呈显著的线性 增加效应 (P <0.05)。添加 0.75×107 CFU/mL 植 物乳杆菌玉米秸秆体外发酵 NH3⁃N 浓度显著高于 对照组和 0.25×107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),且 0.50×107 CFU/mL 添加组亦极显著高于对照组 (P <0.01),而与 0.25×107 CFU/mL 添加组没有显 著差异 (P >0.05),且 0.25×107 CFU/mL 添加组和 对照组亦没有显著差异 (P >0.05)。添加 0.75×107 CFU/mL 植物乳杆菌水稻秸秆体外发酵 NH3⁃N 浓度显著高于对照组及 0. 25 ×107和 0. 50 × 107 CFU/mL 添加组 (P <0.05),而后 3组之间没有 显著差异 (P >0.05)。发酵底物 、植物乳杆菌添加 水平以及两者之间的交互效应对体外发酵 pH 均 没有显著影响 (P >0.05)。 表 6 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵 48 h NDFD 和 DMD 的影响 Table 6 Effects of different supplemental levels of Lactobacillus plantarum on NDFD and DMD of 48 h in vitro fermentation of maize stover and rice straw % 水平 Levels /(×107 CFU/mL) P值 P⁃values 项目 底物 平均值 SEM 底物 水平 交互效应 Items Substrates Mean 0 0.25 0.50 0.75 Substrate Level Interaction 玉米秸秆 39.09 41.35 39.98 37.04 38.00 5.16 0.371 7 0.929 1 0.991 2 中性洗涤纤维降解率 NDFD Maize stover 水稻秸秆 35.79 36.44 36.53 35.45 34.72 0.994 1 Rice straw SEM 2.58 干物质降解率 玉米秸秆 Maize stover 47.80 50.79 44.40 47.42 48.58 4.04 0.184 6 0.781 9 0.848 6 DMD 水稻秸秆 Rice straw 43.97 44.83 44.76 43.55 42.73 0.970 8 SEM 2.02 表 7 植物乳杆菌不同添加水平对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵 48 h NH3 ⁃N 浓度和 pH 的影响 Table 7 Effects of different supplemental levels of Lactobacillus plantarum on NH3 ⁃N concentration and pH of 48 h in vitro fermentation of maize stover and rice straw 项目 底物 水平 Levels /(×107 CFU/mL) 平均值 SEM Mean 0 0.25 0.50 0.75 P值 P⁃values 底物 水平 交互效应 Items Substrates Substrate Level Interaction 玉米秸秆 2.21 1.87c 1.98bc 2.36ab 2.61a 0.17 0.943 3 L(<0.000 1) 0.639 5 氨态氮 NH3 ⁃N /(mg/dL) Maize stover 水稻秸秆 2.19 1.95b 2.08b 2.08b 2.67a L(<0.000 1) Rice straw SEM 0.08 玉米秸秆 Maize stover 6.41 6.42 6.41 6.40 6.40 0.03 0.432 8 0.972 5 0.928 5 pH 水稻秸秆 6.46 6.45 6.46 6.47 6.47 0.969 9 Rice straw SEM 0.01 3 讨 论 低添加水平的植物乳杆菌一定程度上可促进 水稻秸秆中后期发酵的进行 ,而高添加水平的植 物乳杆菌对水稻秸秆体外发酵的促进作用不明 显 。瘤胃内的气体主要来源于瘤胃微生物消耗可 溶性碳水化合物和其他营养物质产生的低级脂肪 酸 、甲烷 、氢气和二氧化碳等代谢产物 。添加植物 乳杆菌能促进玉米秸秆前期体外发酵 ,相反对水 稻秸秆体外发酵中后期发酵促进作用则更加明 显 ,这可能与玉米秸秆和水稻秸秆 2种发酵底物 植物细胞壁结构和养分释放规律的差异有关 。 体外发酵产气量一定程度上可以反映出发酵 底物为瘤胃微生物所利用的程度 [22],同时利用产 气量 ,能有效预测体内干物质的降解率以及代谢 能 [23]。 Muck 等 [24]研究报道 ,体外发酵过程中 65%~70%产气量在发酵初期 9~10 h 内产生 ,而 本试验中 ,玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵达 1/2理论最大产气量的时间分别约为 15和 19 h ,即 2种底物体外发酵产气量达到总产气量 50%时所需 时间分别约为 15和 19 h ,明显高于 Muck 等 [24]所 报道的结论 ,可能是由于两者体外培养方式的不 同而导致产气速率上存在差异 。 Contreras⁃Govea 等 [6]利用植物乳杆菌接种青 贮饲料进行体外发酵 ,研究结果证实 VFA 浓度也 没有显著改变 ,这与本试验结果一致 。通过青贮 饲料接种微生物进行体外发酵 ,证明微生物能够 影响体外发酵 VFA 浓度 [22];同时体外瘤胃接种乳 酸菌亦能够影响 VFA 的组成 [25-26]。在本试验中 ,除戊酸外 ,添加不同水平植物乳杆菌对其他 VFA 浓度以及乙酸 /丙酸并无显著影响 ,VFA 浓度只在 添加植物乳杆菌的不同底物间存在显著差异 ,可 能由于发酵底物化学成分以及细胞比结构不同引 起的 。 2种底物不同的有机物含量以及矿物质含 量均会导致不同的发酵液 VFA 浓度 [21-28],此外 ,2种秸秆不同的细胞壁结构 ,也可能是造成 VFA 浓 度不同的原因 。张元庆等 [29]研究报道 6种不同来 源植物细胞壁发酵产生总 VFA 及其除丁酸外的其 他 VFA 组分浓度均存在显著性差异 。 通过对添加植物乳杆菌的青贮饲料进行体外 发酵试验结果表明 ,与对照组相比 ,添加植物乳杆 菌的青贮饲料 NDFD 和 DMD 均无显著差异 [6];利 用全株玉米做发酵底物进行体外发酵时 ,也得到 类似结论 [30],这与本试验结果一致 。而利用植物 乳杆菌发酵青贮饲料 ,结果表明该菌可提高体外 DMD [4],二者之间的差异可能是由于发酵底物不 同而造成的 。此外 ,随着植物乳杆菌添加量的增 加 ,玉米秸秆和水稻秸秆体外 DMD 亦不断增加 ,且体外产气量也随之增加 ;产气量与 DMD 之间存 在高度正相关 [31],此结论与本试验结果相符合 。在本试验中 ,玉米秸秆体外平均 DMD 和 NDFD 均 高于水稻秸秆 ,造成此种差异除化学组成存在差 异外 ,微生物与底物的吸附能力以及底物的结构 也可能是造成此种差异的原因之一 。 Fernando 等 [32]报道 ,细菌与底物的吸附能力是影响底物消 化率的重要因子 ,徐俊等 [33]研究报道 ,苜蓿茎被瘤 胃微生物降解的速率及程度受其组织结构及组分 影响 ,同时其指出微生物对植物组织的吸附方式 的不一致性也可能是造成不同底物纤维降解率不 同的原因之一 。 随着体外发酵时间的延长 ,NH3⁃N 浓度和产 气量上升趋势一致 ,表明植物乳杆菌对体外瘤胃 发酵氮代谢具有一定的影响 。孟庆翔等 [34]研究指 出 ,体外发酵 NH3⁃N 浓度与体外产气量存在高度 正相关 ( r >0.99)。 Hu 等 [8]利用植物乳杆菌对干 物质含量不同的青贮玉米秸秆进行体外发酵 ,结 果表明植物乳杆菌能显著降低 NH3⁃N 浓度 ,这可 能是由于发酵底物营养成分不同所致 。瘤胃液 pH 常作为衡量瘤胃内营养物质发酵的重要生化指标 之一 ,它的稳定直接影响着瘤胃内生态系统的多 样性 ,并直观地反映动物体的健康状况 [35]。本试 验 pH 为 6.40~6.47,属于反刍动物体内瘤胃液 pH 的正常范围 [36],且随添加量增加 ,并无显著变化 ,这与体外发酵 VFA 浓度变化保持一致 。但也有研 究报道用植物乳杆菌发酵青贮饲料后 ,pH 降到 4以下 [37],此结果可能是由于青贮饲料中含有大量 微生物以及有机物所致 。 4 结 论 ①添加植物乳杆菌能显著提高玉米秸秆体外 发酵初期的产气速率和产气量 (1~24 h ),以添加 0.75×107 CFU/mL 效果最为理想 。 ②添加植物乳杆菌能显著提高水稻秸秆体外 发酵后期 (36 ~ 48 h )产气量 ,以添加 0. 25 ×107CFU/mL 效果最为理想 。 ③随着植物乳杆菌添加水平的增加 ,玉米秸 秆和水稻秸秆体外发酵 NH3⁃N 浓度均呈现显著的 线性性增加效应 ,表明添加植物乳杆菌能促进 2种底物体外发酵氮代谢 ,同时对维持 pH 的稳定平 衡具有积极作用 。 参考文献 : [ 1] 陈亮 ,周传社 ,方俊 ,等 .单菌株与多菌株微生态制剂 在提高奶牛产奶性能上的应用 [ J ] .饲料工业 ,2013,34(4):11-15. 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Effects of Lactobacillus plantarum on in Vitro Rumen Fermentation Characteristics of Maize Straw and Rice Straw CHEN Liang1,2 REN Ao1,2∗ LI Bin3 ZHOU Chuanshe2,4∗∗ TAN Zhiliang2 (1. College of Animal Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha 410128, China ; 2. Key Laboratory for Agri⁃Ecological Processesin Subtropical Region , Hunan Research Center of Livestock &Poultry Sciences , South Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in Ministry of Agriculture ,Institute of Subtropical Agriculture , Chinese Academy of Sciences , Changsha 410125, China ; 3. Institute of Animal Science of Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences , Lhasa 850000, China ; 4. Hunan Co⁃Innovation Center of Animal Production Safety , Changsha 410128, China ) Abstract : The objective of this trial was to explore and the effects of Lactobacillus plantarum on the character⁃istics of in vitro ruminal fermentation of maize straw and ricestraw in dairy cows. The trial was conducted as one⁃factor block experimental design , and four supplementallevels [0 ( control ), 0.25×107, 0.50×107and 0.75×107CFU/mL ] of Lactobacillus plantarum were designed to analyze the influence on in vitro fermentation gas production (1, 2, 4, 6, 12, 24, 36 and 48 h ), gas production parameters , dry matter degradability (DMD ), neutral detergent fiber degradability (NDFD ),and concentrations of volatile fatty acid (VFA ) and ammonia nitrogen (NH3⁃N ), as well as pH in fermentation fluid. The results showed that the supplementation of Lactobacillus plantarum could significantly increase theoretical maximum gas production and gas production at 1 to 24 h of maize straw (P <0.05), and the optimum supplemental level was 0.75×107 CFU/mL ; the sup⁃plementation of Lactobacillus plantarum could significantly increase gas production at 36 to 48 h (P <0.05),and the optimum supplemental level was 0.25×107 CFU/mL. NH3⁃N concentration of two substrates of in vitro fermentation was enhanced linearly and significantly with the improvement of supplemental level of Lactobacil⁃lus plantarum (P <0.05) . However , there were no significant differences on NDFD , DMD , and VFA ( acetic acid , propionic acid , isobutyric acid , butyric acid and valeric acid ) concentrations and pH of fermentation flu⁃id with the change of supplemental levels of Lactobacillus plantarum (P >0.05) . The results suggest that adding Lactobacillus plantarum can promote in vitro fermentation and nitrogen metabolism ,and maintain pH balance of maize straw and rice straw , the optimal supplementallevels of which are 0.75×107and 0.25×107 CFU/mL , respectively.[Chinese Journal of Animal Nutrition , 2017, 29(2):678⁃689] Key words : Lactobacillus plantarum ;in vitro fermentation ;rumen ; dairy cows ; maize straw ;ricestraw ∗Contributed equally
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