使用疏水填料TOYOPEARL PPG-600M分离抗体药物偶联物的DAR

抗体药物偶联物（ADCs）的纯化工艺十分复杂，其主要挑战在于分离未结合的抗体和游离药物，以及确定与抗体结合的药物的平均数量分布，即药物/抗体比率（DAR）。DAR值的增加会使ADCs的疏水性变强，利用该特点可分离不同DAR值的ADCs。东曹的疏水层析填料TOYOPEARL PPG-600M采用了相对亲水的配体，具有高回收率、结合能力强、工作pH范围宽等优点。本应用是采用了该款填料对ADCs模拟物的纯化进行了研究。 使用 ®TOYOPEARL PPG-600M填料纯化抗体药物偶联物 用于分离DAR的HIC填料 简介 抗体药物偶联物（ADCs）由三部分组成：对细胞表面癌症抗 原具有特异性的单克隆抗体（mAb）、高效的细胞毒性药物 （有效载荷）和将细胞毒性药物与mAb共价连接的连接物。ADCs是用于治疗癌症及其他需化疗的疾病年增长率最高的药 物之一。由于其有效载荷具有极高的毒性，在方法和工艺开发 过程中有必要执行较高的安全标准。 由于偶联物的异质性，ADCs的纯化工艺十分复杂。其主要挑 战在于分离未结合的抗体和游离药物，以及确定与抗体结合的 药物的平均数量分布，这与ADC的效力相关，即药物／抗体 比率（DAR）。高DARs与高细胞毒性相关，能够导致聚集，进 而影响ADC的稳定性。另一方面，低DARs又会影响治疗效果。 ADC模拟物的有效载荷没有毒性，却具有与ADC的毒性有效载荷 相似的结构和理化特性。因此，可作为开发纯化工艺或分析方法的 模型使用。本研究中所用的ADC模拟物是由阿达木单抗与5-异硫 氰酸荧光素（FITC）结合而成。如质谱评估所示，模拟物显示出了 与真实ADCs相似的DAR，因此它是开发分析和制备方法的一个 实用工具。 有效载荷具有疏水性，因此ADCs的疏水性比正常的单克隆抗 体更强。DAR值的增加会使ADC的疏水性增强，该特点可用 于分离不同DAR值的ADC。ADC模拟物的纯化研究中使用了 HIC层析填料TOYOPEARL PPG-600M，其采用了相对亲水的 配体，使TOYOPEARL PPG-600M具有回收率高、结合能力 强、工作pH范围宽的优点。 材料与方法 本实验中使用的抗体是Humira®阿达木单抗的生物类似药。ADC模拟物由荧光素-5-异硫氰酸酯通过赖氨酸基团与抗体进 行异质、随机偶联而成。 本实验采用了TOYOPEARL PPG-600M，65μm，50 nm疏水填 料。实验时，将其装填到了Omnifit® Benchmark色谱柱中（6.6mm ID×10 cm）。 使用TSKgel® Butyl-NPR分析柱（2.5μm，4.6 mm ID×3.5 mm）对收集的ADC模拟物片段进行分析。 使用TOYOPEARL PPG-600M纯化ADC模拟物 将ADC模拟物注入TOYOPEARL PPG-600M色谱柱，按低、中、高DAR值分离ADC模拟物片段 （图1）。 图1.在TOYOPEARL PPG-600M层析柱中使用70-80-100% B三步 梯度法分离ADC模拟物 可以调整各个步骤中的低盐缓冲溶液，更改分离度： 1. 平衡（5 CV， 250 cm/h）：100 mmol/L磷酸钠，1.5 mol/L硫酸铵，pH 6.5 2. 上样（5 mg/mL填料， 150 cm/h）：FITC-阿达木单抗-模拟 物 3. 清洗（5 CV， 250 cm/h）：100 mmol/L磷酸钠，1.5 mol/L硫酸铵，pH 6.5 4. 洗脱1（5 CV， 175 cm/h）：30 % 100 mmol/L磷酸钠，1.5 mol/L硫酸铵，pH 6.5 + 70% 100 mmol/L磷酸钠pH 6.5 5. 洗脱2（5 CV， 175 cm/h）：20% 100 mmol/L磷酸钠，1.5 mol/L硫酸铵，pH 6.5 + 80% 100 mmol/L磷酸钠pH 6.5 6. 洗脱3（5 CV， 175 cm/h）：100 mmol/L磷酸钠 pH 6.5 7. 再生（5 CV， 250 cm/h）：500 mmol/L氢氧化钠 8. 平衡（5 CV， 250 cm/h）：100 mmol/L磷酸钠，1.5 mol/L硫酸铵，pH 6.5 使用TSKgel Butyl-NPR分析DAR 在TSKgel Butyl-NPR色谱柱上对每个洗脱步骤的洗脱溶液进行 了分馏和分析。由于FITC（495 nm）和抗体（280 nm）的最大 吸光率不同，因此可以使用下述公式计算UV-DAR估值 （图2）： 图2. TOYOPEARL PPG-600M填料上ADC模拟物的吸光率差异 及各个洗脱步骤的DAR估值 每个条形图上蓝色表示抗体的ADC模拟物的吸光率，红色表 示FITC的ADC模拟物的吸光率。使用TSKgel Butyl NPR色 谱柱分析了分级梯度的片段。 结论 由于耦合的随机性和异质性，我们发现DAR值的变化范围较 大，为0到6。因此，ADC的纯化过程也比定点ADC分离更 为复杂。 尽管如此，TOYOPEARL PPG-600M填料在分级梯度中仍然具 有足够高的选择性，能够将ADC偶联物按低、中、高三组不 同的DARs进行分离。低DAR片段的DAR均值为1，中DAR 片段为3，高DAR片段的DAR中值为5。 所有获批ADCs的DARs值均介于2到4之间。在分级梯度期 间微调浓度，可以调整该过程以分离出目标DAR范围内的 ADCs。 Tosoh Bioscience、TSKgel和TOYOPEARL是Tosoh Corporation的注册商标。Humira是AbbVie Inc.的注册商标。 Omnifit是Bio-Chem Fluidics有限公司的注册商标。