单克隆抗体中层析纯化工艺及HPLC质量控制检测方案(液相色谱柱)

TOYOPEARL TOYOPEARL 抗体药物的层析纯化工艺及HPLC品质管理方法 TOYOPEARL， TSKgel 系列产品一 抗体的层析纯化工艺 随着生物制药以及诊断试剂领域对单克隆抗体的需求日益旺盛，需要更大量、更高纯度的抗体产品。因此，通过层析法实现抗体的下游纯化变得日趋重要。 单抗纯化的各种层析模式的特点如表1所示。各种模式中， Protein A 亲和层析法可获得高纯度的单抗，因此普遍被用于初始纯化步骤(即初期捕获)中。离子交换层析法(IEC)的高载量特点也使之在抗体的制备纯化中被广泛采用。疏水相互作用层析法(HIC)在去除抗体多聚体以及脱落的 Protein A 配体等杂方方面具有明显优势。混合模式层析法(MXC)可以在高盐浓度的样品溶液中也能吸附样品，因此也被运用到了抗体的层析纯化工艺中。 图1是抗体纯化的工艺平台示例。在纯化工艺的第一步捕获使用 Protein A 亲和层析， 其后步骤使用阳离子交换层析、阴离子交换层析去除杂质(宿主细胞蛋白、核酸、抗体多聚体、脱落的Protein A配体)，获得高纯度的抗体。 表1.各种层析分离模式的特长 对抗体的载量 获得的抗体纯度 填料的清洗 填料的成本 亲和层析法 ++ +++ ++ + 阳离子交换层析法 +++ ++ +++ +++ 疏水相互作用层析法 ++ ++ +++ ++ 混合模式层析法 十 ++ ++ ++ ++：：优秀 +：有待进一步改善 图1.抗体纯化的工艺平台示例 表2.用于单克隆抗体纯化的TOYOPEARL填料产品 分离模式 推荐产品 载量 产品特点 AFC TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F ≥68 g/L 耐碱、高载量 TOYOPEARL AF-rProtein L-650F ≥64 g/L 适用于抗体片段 IEC TOYOPEARL GigaCap S-650M 136-176 g/L 高载量 TOYOPEARL Sulfate-650F 2114 g/L 耐盐、去除多聚体 TOYOPEARL GigaCap Q-650M ≥162 g/L(*1) 流穿模式、高载量 TOYOPEARL NH2-750F ≥70g/L 流穿模式、高载量 MXC TOYOPEARL Mx-Tp-650M 275 g/L 混合模式、耐盐、去除多聚体 HIC TOYOPEARL Phenyl-600M 45-65g/L(*2) 高载量、高回收率 TOYOPEARL PPG-600M 20-35g/L 适用于疏水性抗体、ADC TOYOPEARL Hexyl-650C 30-50 g/L(*2) 低盐浓度下流穿模式 (*1) BSA、(*2)溶菌酶 Protein A、Protein L 亲和填料 由于在捕获步骤中需要对大量细胞培养液快速纯化，Protein A亲和被料被广泛地应用于这一阶段。 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 是一款高载量耐碱型的亲和填料，重组 Protein A 配基多位点键合在填料骨架上优化抗体纯化(图2)。即使是高滴度、高浓度(10g/L)的单抗样品，在常用流速下也具有非常高的动态载量(图3)。同时具有非常低的配基脱落率(图4)，能有效去除 HCP(图5)。此外，采用碱性溶液反复清洗(CIP)后，载量并没有显著降低。 Protein L 填料对单克隆抗体的 kappa轻链有亲和作用，对于 Fab、scFv这些不含有 Fc区域， 无法通过 Protein A填料进行纯化的抗体片段，则可选择 Protein L 填料。 与以往市面上的 Protein L 填料相比， TOYOPEARLAF-rProtein L-650F 在载量和耐碱性方面有了显著的提升(图6、7)，所以此款填料更适用于实际生产过程。除抗体片段以外， Protein L还可结合其他抗体种类如IgM、IgA 等，因此 Protein L 是对 Protein A 的一个很好的补充。 离子交换填料 离子交换层被广泛应用于 Protein A 亲和层析之后的中间纯化和最终精纯步骤中。随着官能团键合技术的进步，目前主流的离子交换填料对于抗体的吸附载量-般都能达到 100-170 g/L。抗体的等电点一般为中性或者弱碱性，所以阳离子交换填料在抗体的纯化工艺中一般适用于吸附-洗脱模式。 TOYOPEARL GigaCap S-650M 对抗体的动态载量非常高，通过优化洗脱液，在1000 cm/h 的线性流速下，动态载量约为90 g/L， 并且可以得到与 Protein A 填料相媲美的纯度(图8)。 TOYOPEARL Sulfate-650F 是一款耐盐型的强阳离子交换填料，即使样品溶液中含盐浓度较高(0.15 mol/LNaCI) 也依然可以吸附目标蛋白 阴离子交换填料在抗体的纯化工艺中一般通过流穿模式来去除样品中的宿主细胞蛋白、核酸、内毒素、多聚体等杂质。TOYOPEARL NH2-750F 是高载量型的优异层析填料，对去除多聚体十分有效(图9)。它与Sulfate-650 一样具有耐盐性。 混合模式填料 此类填料的官能团即具有离子性，又具有疏水性。混合模式填料对于含有一定盐浓度(0.15mol/L NaCI)的单抗样品可以进行直接上样，进行吸附和洗脱分离。 TOYOPEARL MX-Trp-650M 的官能团为色氨酸，对抗体具有非常高的动态载量(75g/L以上)。 疏水填料 疏水相互作用层析法不仅可以分离诸如宿主细胞蛋白、核酸、脱落的蛋白A配体等杂质，还可以分离抗体的多聚体和异构体。 被称为第二代疏水层析填料的 TOYOPEARL 600 系列产品，通过优化填料的孔径从而大大提高了对单抗的吸附载量。抗体的动态吸附载量一般为 20-45 g/L， 但是我们需要通过抗体的疏水性、回收率、分辨率等条件来选择最优的疏水填料。一般而言，苯基和丁基 (TOYOPEARLPhenyl-650M、Phenyl-600M、Butyl-650M、Butyl-600M)适用于单抗的分离，但是对于疏水性比较强的抗体则需要选择疏水性比较弱的 TOYOPEARL PPG-600M疏水填料。最新的研究中，有使用混合盐溶液 (Dual salts) 来提高吸附载量的案例， TOYOPEARL Hexyl-650C 在流穿模式的运用， TOYOPEARL Phenyl-650、Butyl-650、PPG-600、Ether-650M 等也被运用在 ADC 药物的分离纯化中。 工艺开发、筛选用预装柱：ToyoScreen@， MiniChrom 产品 ToyoScreen 筛选用预装柱(1ml及及5ml装)包括各种层析模式，可用于层析填料的筛选、精制纯度和回收率的研究以及层析条件的优化工作等方面。面 HPLC或 MPLC 系统连用可简单地对抗体的分离效果进行评估。 MiniChrom 预装柱体积为5mL， 柱尺寸为 8 mm I.D.×10 cm， 用于优化分离条件、料料筛选以及小规模的制备纯化。在常规液相色谱仪上使用 ToyoScreen预装柱进行高通量筛选后进一步的条件优化、以及对操作条件的适用范围进行确认时，都可以使用到 MiniChrom预装柱 图2. TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 对单抗的动态吸附载量(样品：治疗性抗体生物仿制药) 图 3. TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F对抗体浓度和动态吸附载量 柱尺寸：10 mmI.D.×50mm 层析柱： TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F (5 mm l.D.×5cm) 样 品：含有1g/L抗体的50 mM HEPES缓冲液+150mMNaCl (pH 7.0) 样 品：分别含有1、5、10 g/L抗体溶液的0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0) +0.15 mol/L NaCl 柱留时间：4分钟(10%穿透曲线测得) 柱留时间：2、3.3、5分钟 检 测： UV (280nm) 图4. Protein A配基的脱落程度比较 市售琼脂糖 Protein A填料(高载量型) 图5. TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 去除 HCP 效果的比较(样品：治疗性抗体生物仿制药) ■纯化前的样品 (CHO细胞培养上清液)m1TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F纯化后■市售琼脂糖 Protein A填料(高载量型)纯化后 图6. TOYOPEARL AF-rProtein L-650F 对 Fab 的动态吸附载量 图7. TOYOPEARL AF-rProtein L-650F 的耐碱性 柱尺寸：4.6 mml.D. ×50 mm) 0.1mol/L NaOH溶液浸泡下的抗体吸附载量变化的比较 样 品：含有2g/L人抗体 Fab 的 0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液(pH6.5)(吸附载量在10%穿透曲线下测得) 图8.抗体洗脱时的洗脱峰宽(洗脱体积) 层析柱尺寸：6mmI.D.×4 cm 上 样： hlgG (1 g/L)、1 mL/min in 0.1 mol/L 的醋酸盐缓冲液(pH4.7) 洗脱： 0.1 mol/L 的醋酸盐缓冲液(pH4.7)+1.0mol/L 的氯化钠 流 速： 2mL/min 图9.去除单克隆抗体中的多聚体 层析柱：5mm I.D.×5 cm (1mL) 缓冲液A： 20 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0) 缓冲液B： 20 mmol/L Tris-HCI+ 1.0 mol/L NaCI (pH 8.0) 梯度洗脱：缓冲液A→B(线性；60 min) 流速： 1.0mL/min 检测： UV (280nm) 样 品：单克隆抗体 (IgG1； 0.5mg) 产品一览表(层层工艺用填料) Protein A、Protein L 亲和层析填料 货号 产品名称 规格 0023425 10mL 0023426 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 25mL 0023427 100 mL 0022803 10mL 0022804 TOYOPEARL AF-rProtein A-650F 25mL 0022805 100mL 0023486 10mL 0023487 TOYOPEARL AF-rProtein L-650F 25mL 0023488 100mL 出货状态：20%的乙醇水溶液中悬浮状态 粒径(溶胀时)： 30~60 um 保存温度：2~8℃ O离子交换层析填料 阴离子交换填料一览表 S M C 产品名称 规格 货号 货号 货号 TOYOPEARL GigaCap Q-650 250mL 0022882 0021855*1 TOYOPEARL GigaCap DEAE-650 250 mL 0022866*1 TOYOPEARL SuperQ-650 250 mL 0017223 0017227 0017231 TOYOPEARL DEAE-650 250mL 0007472 0007473 0007988 TOYOPEARL Q-600 AR 250 mL 0021986 TOYOPEARL QAE-550 250 mL 0014026 TOYOPEARLNH2-750 250 mL 0023439*2) 出货状态：20%的乙醇水溶液中悬浮状态 粒径(溶胀时)：S (Super Fine； 20~50pm) /M (Medium； 40~90pm) /C (Coarse； 50~150pm) *1)50~100pm *2) F (Fine； 30~60pm) 产品名称 规格 S M C 货号 货号 货号 TOYOPEARL GigaCap S-650 250 mL 0022876 0021834*3) TOYOPEARL GigaCap CM-650 250mL 0021947*3) TOYOPEARL SP-650 250 mL 0008437 0007997 0007994 TOYOPEARL CM-650 250 mL 0007474 0007475 0007991 TOYOPEARL SP-550 250 mL 0014028 TOYOPEARL MegaCap II SP-550 250 mL 0021805*4) TOYOPEARL Sulfate-650 250 mL 0023468*5) 出货状态：20%的乙醇水溶液中悬浮状态 (Sulfate-650除外) ( Sulfate-650填料的出货状态：含有0.2mol/L醋酸钠的乙醇水溶液中悬浮状态。 ) ( 粒径(溶 胀 时)： S ( S u p er Fine； 20~50pm) / M ( M edium； 40~9 0 pm) /C (Coarse； 50~150pm) ) *3)50~100pm *4) EC (Extra Coarse； 100~300pm) *5) F (Fine； 30~60pm) 混合模式层析填料 货号 产品名称 规格 0022817 TOYOPEARL MX-Trp-650M 25mL 0022818 100 mL 疏水填料 一览表 规格 S M C 产品名称 货号 货号 货号 TOYOPEARL Hexyl-650 100 mL 0019026 TOYOPEARL Butyl-650 100mL 0007476 0007477 0007478 TOYOPEARL SuperButyl-550 100 mL -— 0019956 TOYOPEARL Phenyl-650 100 mL 0014477 0014478 0014479 TOYOPEARL Ether-650 100 mL 0016172 0016173 TOYOPEARL Phenyl-600 100mL 0021888 TOYOPEARL PPG-600 100 mL 0021302 TOYOPEARL Butyl-600 100 mL 0021449 出货状态：20%的乙醇水溶液中悬浮状态 粒径(溶胀时)： S (Super Fine； 20~50 pm) /M (Medium； 40~90 pm) /C (Coarse； 50~150 pm) 工艺开发、筛选用预装柱 (ToyoScreen 产品) 离子交换填料 货号 5mL×6 货号 ToyoScreen GigaCap Q-650M 0021859 0021860 ToyoScreen GigaCap DEAE-650M 0022872 0022873 ToyoScreen DEAE-650M 0021360 0021361 ToyoScreen SuperQ-650M 0021362 0021363 ToyoScreen QAE-550C 0021364 0021365 ToyoScreen GigaCap S-650M 0021868 0021869 ToyoScreen GigaCap CM-650M 0021951 0021952 ToyoScreen MegaCap II SP-550EC 0021870 0021871 ToyoScreen CM-650M 0021366 0021367 ToyoScreen SP-650M 0021368 0021369 ToyoScreen SP-550C 0021370 0021371 ToyoScreen Q-600C AR 0021992 0021993 ToyoScreen NH2-750F 0023443 0023444 ToyoScreen Sulfate-650F 0023472 0023473 ToyoScreen IEC 0021396*1) 0021397*1) ToyoScreen A-IEC 0021392*2) 0021393*2) ToyoScreen C-IEC 0021394*3) 0021395*3) *1) 6种 (GigaCap Q-650M、GigaCap S-650M、GigaCap CM-650M、SuperQ-650M、Q-600C AR、SP-550C)各1支的套装 *2)5种 (GigaCap Q-650M、DEAE-650M、SuperQ-650M、Q-600C AR、QAE-550C) 各1支的套装 *3)5种 (GigaCap S-650M、GigaCap CM-650M、CM-650M、SP-650M、SP-550C) 各1支的套装 疏水填料 产品名称 1mL×6 5mL×6 货号 货号 ToyoScreen Ether-650M 0021372 0021373 ToyoScreen Phenyl-650M 0021374 0021375 ToyoScreen Butyl-650M 0021376 0021377 ToyoScreen Hexyl-650C 0021378 0021379 ToyoScreen Phenyl-600M 0021892 0021893 ToyoScreen PPG-600M 0021380 0021381 ToyoScreen Butyl-600M 0021494 0021495 ToyoScreen SuperButyl-550C 0021382 0021383 ToyoScreen HIC 0021398*4) 0021399*4) *4)6种 (Phenyl-600M、PPG-600M、Phenyl-650M、Hexyl-650C、Butyl-600M、Butyl-650M)各1支的套装 产品名称 1mL×6 5mL×6 货号 货号 ToyoScreen MX-Trp-650M 0022824 Protein A、Protein L填料 产品名称 1mL×5 5mL×1 5mL×5 货号 货号 货号 ToyoScreen AF-rProtein A HC-650F*5) 0023430 0023431 0023432 ToyoScreen AF-rProtein A-650F*5) 0022809 0022810 0022811 ToyoScreen AF-rProtein L-650F*5) 0023494 0023495 0023496 *5)保存温度：2~8℃ 货号 产品名称 内容物 *6) 柱身、柱头(1mL装进口处用)、柱头(5mL装进口处用)、 0021400 ToyoScreen Holder柱头(出口处用)各1个；柱栓2个 0020028 T-Funion (M6 10-32) FPLC连接件 *6)使用 ToyoScreen 预装柱时，必须使用货号为 0021400的ToyoScreen Holder 产品(预装柱柱套)。 使用ToyoScreen预装柱与FPLC系统连接时，需要使用货号为 0020028 的 T-Funion 连接件。 FPLC是GE公司的注册商标。 货号 产品名称 色谱柱尺寸 柱体积 粒径 0045101 TOYOPEARL GigaCap S-650M 8mm.I.D.x 10 cm 5mL 50~100 pm 8 mm.I.D.×10 cm 5mL 20~ 50 pm 0045102 TOYOPEARL GigaCap S-650S 0045103 TOYOPEARL GigaCap CM-650M 8 mm.I.D.x 10 cm 5mL 50~100 pm 0045104 TOYOPEARL GigaCap Q-650M 8 mm.I.D.×10 cm 5mL 50~100 pm 0045105 TOYOPEARL GigaCap Q-650S 8 mm.I.D.x 10 cm 5mL 20~ 50 pm 0045106 TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M 8 mm.I.D.x 10 cm 5mL 50~100 pm 0045107 TSKgel SuperQ-5PW (20) 8mm.l.D.× 10 cm 5mL 15~ 25 pm 0045108 TOYOPEARL NH2-750F 8 mm.I.D.×10 cm 5mL 30~60pm 0045117 TOYOPEARL Sulfate-650F 8mm.I.D.x 10 cm 5mL 30~ 60 pm 0045121 TOYOPEARL Phenyl-650M 8 mm.l.D.× 10 cm 5mL 40~990o pm 0045122 TOYOPEARL Phenyl-650S 8 mm.l.D.x 10 cm 5mL 20~50pm 0045123 TOYOPEARL Phenyl-600M 8 mm.I.D.x 10 cm 5mL 40~990pm 0045124 TOYOPEARL PPG-600M 8mm.I.D.x 10 cm 5mL 40~ 90 pm 0045125 TOYOPEARL Butyl-650M 8 mm.I.D.x 10 cm 5mL 40~990opm 0045126 TOYOPEARL Butyl-650S 8 mm.I.D.× 10 cm 5mL 20~50pm 8 mm.I.D.x10 cm 5mL 40~90pm 0045127 TOYOPEARL Butyl-600M 0045151 TOYOPEARL MX-Trp-650M 8 mm.I.D.x10 cm 5mL 50~1001ipm 0045161 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F*7) 8 mm.I.D.x10 cm 5mL 30~60pm 0045162 TOYOPEARL AF-rProtein L-650F*7) 8 mm.I.D.x 10 cm 5mL 30~ 60 pm *7)保存温度：2~8℃ 抗体药物的HPLC品质管理与分析 抗体是一种结构复杂的糖蛋白。即使是天然抗体，其结构也是各不相同。基因重组抗体更会因为生产工艺(培养、分离纯化)的不尽相同而导致产品的差异性。确认这些差异性的品质管理工作大为重要。这些差异性包括抗体蛋白的二聚体、多聚体、脱酰胺化、末端氨基酸突变以及糖链部分的结构差异。这些差异性均可以通过高效液相色谱(HPLC)法来进行分析。 尺寸排阻色谱法 抗体(IgG1)的分子量大约为150kDa， 根据分子量大小来对抗体二聚体、多聚体(三聚体或三聚体以上)以及抗体降解产物进行分离、定量时， 可使用 TSKgelG3000SWx或 TSKgel SuperSW3000色谱柱。如要同时分离二聚体、单体及抗体降解产物，则推荐使用分离性能更高的 TSKgel SuperSW mAb HR 这款色谱柱(图1).另外，如果在 UHPLC 系统或者检测池体积小、管路体积小的HPLC系统中分离抗体，建议使用粒径2pm，规格为4.6 mm ID×30 cm 的高性能色谱柱 TSKgel UP-SW3000。图2是分别采用2根 TSKgel G3000SWxL串联，以及1根TSKgel UP-SW3000 分离抗体的谱图。如果是候选药物筛选这种需要在短时间内完成大量分析的情况下， 15cm规格的TSKgel UP-SW3000 短柱更加适合，可以在5分钟内完成分离(图3)，比其他市售的1.7 pm 粒径的 SEC色谱柱获得更好的分离效果。 为确保抗体药物的安全性，对多聚体的分析检测是非常重要的。如果现有的 SEC 色谱柱无法很好地分离出三聚体以上的多聚体时，推荐使用 TSKgel UltraSWAggregate，这款色谱的排阻界限比G3000SWxl更高，非常适合用来分析抗体多聚体。使用 SEC 法来分离蛋白质等生物大分子样品时，可通过降低流速来提升分离度。TSKgel UltraSW Aggregate 在低流速条件下(0.2mL/min)可以将单克隆抗体多聚体中的五聚体也分离出来(图4)。 抗体药物偶联物 (Antibody-drug conjugate； ADC)是一类新颖的抗体药物，近年来成为研发热点。由于ADC中的小分子药物的疏水性比抗体高，所以在磷酸盐缓冲液这种流动相条件下回收率较低，有时会发生峰拖尾，此时在流动相中添加有机溶剂或精氨酸，可以改善这种情况(见图5)。 离子交换色谱法 抗体纯化产物中，即使是分子量相同的组分也可能存在电荷异构体(脱酰胺化、末端氨基酸突变)和糖链构造异构体(糖型)等杂质。为了分析这些组分可以通过离子交换色谱法(IEC)。 使用 TSKgel CM-STAT 或 SP-STAT 离子交换色谱柱，可快速、高分辨率分析抗体药物中的电荷异构体(图6)。人IgGH链C末端的赖氨酸(Lys)残基在羧肽酶作用下容易发生断裂，导致赖氨酸残基的缺失而出现异构体。分析此类电荷异构体可以通过阳离子交换色谱法(见图7)。使用 TSKgel CM-STAT 色谱柱分离完整的抗体可得到三个主要的色谱峰(见图7下半部分)经过羧肽酶处理后，分析结果只检测到一个主要的色谱峰(见图7上半部分)，所以可以得知三个色谱峰分别是 Lys残基数各不相同的电荷异构体。 天冬酰胺(Asn)残基的脱酰胺基化和天冬氨酸(Asp)残基的异构化容易经常发生。针对单克隆抗体L链的脱酰胺化产物(Asp30)、以及H 链Asp102的异构化产物(isoAsp102)， 采用阳离子交换色谱法进行分离的实例见图8、图9所示。CIEC 法检测完整抗体的结果显示 Asp30 和 isoAsp102的分离不完全(图8)。取各峰组分用木瓜蛋白酶水解后， CIEC 法分析 Fc、Fab部分，从分离结果可看出Asp30、isoAsp102 被很好地分离开来(图9)。这种分析方法也可以用来分离双特异性抗体。 疏水相互作用色谱法 抗体Fc区的甲硫氨酸残基(Met)的氧化是抗体不均一性的又一表现。抗体的木瓜蛋白酶解产物可以用疏水相互作用色谱法(HIC)来检测被氧化的 Met 残基。使用TSKgel Butyl-NPR色谱柱的分析实例如图10所示。 由于抗体多聚体的疏水性比单体高，所以利用疏水性差异的原理通过疏水相互作用色谱法(HIC)可实现抗体单体和多聚体的分离。在硫酸铵作为洗脱液的条件下几乎无法分离出来，但使用氯化钠作为洗脱液时可以很好地将单体和多聚体分离出来(图11)。 ADC 药物是将多个小分子药物链接到抗体分子的不同位点，结合部位以及结合数量的不同会导致不均一性。然而小分子药物比抗体分子具有更高的疏水性，所以利用HIC 法可检测 ADC 的不均一性。图12是 HIC 法对结合了不同数目的小分子药的 ADC 进行分离分析的色谱图。 亲水相互作用色谱法 亲水相互作用色谱法(HILIC)是一种对高亲水性化合物保留、分离的分析模式。常用于亲水性低分子、核酸、糖类等化合物的分离分析。 TSKgel Amide-80 和TSKgelNH2-100 色谱柱可用于分析结合在抗体上的糖链结构差异性。人 IgG 来源的N-末端糖链用 2-AB荧光标记后，使用TSKgel Amide-80 2pm 色谱柱分析的色谱图见图13。 反相色谱法 反相色谱法与质谱(MS) 联用法通常会被运用在肽图谱分析中。用来分析抗体降解产物、片段(Fab、Fc、H链、L链等)、以及片段异构体。图14是使用 TSKgelProtein C4-300 色谱柱分离鼠单抗还原产物的色谱图。 亲和色谱法 亲和色谱法是一种基于生物大分子或小分子物质的亲和力的分离方法。Protein A、Protein G、Protein L 这些蛋白质可以与抗体结合，所以通常作为亲和配基被偶联到填料基质上，用于分离抗体。TSKgel Protein A-5PW是一款键合有重有 Protein A 配基的亲和色谱柱，具有耐碱性、抗体吸附捧量高、定量范围广和使用寿命长等特点。并且，还可以在短时间内(1分钟以内)对抗体体速分析。图15是使用 TSKgel Protein A-5PW分析 CHO细胞培养上清液中的抗体的色谱图。 苯硼酸在碱性条件下与1，2-顺式二醇基相结合，基于这个原理以苯硼酸为配基的亲和色谱柱通常用于分离糖蛋白等生物分子。图16所示为 TSKgel Boronate-5PW色谱柱分析糖基化抗体的谱图。 分离模式 分离原理 特长及用途 色谱柱 尺寸排阻色色法(SEC) 分子的空间尺寸 适用于抗体的单体与多聚体(二聚物、四聚物等)的分离，或者单体与抗体低分子降解产物的分离。有时也可将两根色谱柱串联起来使用。 TSKgel UP-SW3000 TSKgel SuperSW mAb TSKgel UltraSW AggregateTSKgel G3000SWxL TSKgel SuperSW3000 TSKgel G2000SWxL TSKgel SuperSW2000 离子交换色谱法(IEC)* 分子的离子性 根据抗体带电荷的差异来实现带电电构体的分离。此类色谱柱采用了非多孔类填料，可以获得高分辨率、快速的分析。 TSKgel CM-STAT TSKgel SP-STAT TSKgel Q-STAT 疏水相互作用色谱法(HIC) 分子的表面疏水性 根据抗体表面的疏水性差异实现分离。特别适用于分离无法通过IEC获得分离的结构同分异构体。 TSKgel Butyl-NPRTSKgel Phenyl-5PW 亲水相互作用色谱法 (HILIC) 分子的亲水性 适用于分离糖基化的抗体结构同分异构体。 TSKgel Amide-80 TSKgel NH2-100 反相色谱法(RPC) 分子的疏水性 适用于高分辨率、肽图、抗体片段的分析。 TSKgel Protein C4-300 亲和色谱法(AFC) 分子间的亲和力 细胞培养液中抗体浓度的定量分析。也适用于对糖化、未糖化的抗体异构体进行分离。 TSKgel Protein A-5PW TSKgel Boronate-5PW 图1.抗体药物的分离分析 色谱柱： A：TSKgel G3000SWxL (5 pm， 7.8 mm I.D.x 30 cmx2) B：TSKgel UP-SW3000 (2 pm， 4.6 mm I.D. x30 cm) 流动相：0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH6.7)+0.1mol/L Na2SO4+0.05% NaNs 流速： A： 1.0 mL/min， B： 0.35 mL/min检温 测： UV(280 nm) 度：25℃ 进样量：10pL 样 品：鼠-人嵌合抗体(单克隆抗体) 1.三聚体2.二聚体3.单体4.片段 使用一根 UP-SW3000 色谱柱即可达到与串联2根 G3000SWxL 相同的分离效果。 图3.单克隆抗体的分离(与市售色谱柱的比较) 色谱柱： A： TSKgel UP-SW3000 (2pm， 4.6 mmI.D. x 15cm) B：市售UHPLC用SEC色谱柱(1.7 pm， 4.6 mm I.D. x 15cm)流动相：0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.7) +0.1 mol/L Na2SO4 +0.05% NaNs 流速：0.35 mL/min 测： UV (280nm) 进样量： 5pL 品：鼠-人嵌合抗体 1.三聚体2.二聚体3.单体4.片段 ·对单克隆抗体的三聚体/二聚体/单体的分离效果更优异。 ( · 对 单体 / 片 段 也表现 出了 良好 的分 离性能 。 ) 图4.多聚体的分离 色谱柱： TSKgel UltraSW Aggregate (7.8 mm l.D. ×30 cm)洗脱液：0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.7)+0.05%NaNs流速：0.2~1.0 mL/min检测： UV (280 nm)温 度： 25℃进样量： 10pL 样品：人单克隆抗体；5g/L 图5. SEC 法分离 ADC药物 10 15 20 min 色谱柱： TSKgel G3000SWxL (7.8 mm I.D.×30 cm)缓冲液： A：0.2mol/L磷酸钾缓冲液+0.25 mol/L KCI (pH 6.95)B：A/异丙醇=85/15流速：0.5mL/min检测：UV (280 nm)样品： Trastuzumab， T-DM1 *A.Wakankar，etal.，mAbs3(2)，161-172，2011 图6.单克隆抗体药物的分离分析---离子交换色谱法(盐浓度梯度) 图7.IEC法分离单克隆抗体(对H链C末端赖氨酸残基缺失型型异体的分析) 色 ： TSKgel CM-STAT(4.6mm I.D.x10 cm) 洗脱液： A： 20 mmol/L MES缓冲液(pH 6.0)+0.05%NaN3 B： 20 mmol/L MES缓冲液+0.5 mol/L NaCI (pH 6.0) 梯 度：0 min 10%B 15 min 30% B 15.1 min 100% B 18 min 100% B 图8.IEC法分离单克隆抗体(对Asn残基的脱酰胺基化、异构体的分析) 图9. IEC法分析单克隆抗体(对图8中各峰组分的片段分析) 色谱柱： TSKgel Butyl-NPR (4.6 mm I.D. ×10 cm)洗 脱液： A：20 mmol/L磷酸缓冲液+2 mol/L 硫酸铵(pH7.0) 色谱柱： TSKgel Butyl NPR (4.6 mm 1.D.×3.5cm)洗脱液： A： 20 mmol/L 磷酸缓冲液+3 mol/LNaCl (pH7.0)B： 20 mmol/L 磷酸缓冲液 (pH7.0)梯 度：0→100%B 10分钟线性梯度流速：1.0mL/min检测：荧光(Ex.280 nm； Em.348 nm)进样量：5pg 图12. HIC法分离曲妥珠单抗和ADC 色谱柱： TSKgel Butyl-NPR(4.6 mm I.D.×10 cm) 洗脱 液： A： 25 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)+1.5 mol/L 硫酸铵 B： 25mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0) / 2-丙醇=8/2 梯度洗脱：0-100%B(20分钟) 流速：0.5mL/min 检测： UV(280 nm) 进样量：10pL 样品浓度：曲妥珠单抗：0.24g/l； ADC (Herceptin-vcMMAE)： 2.2 g/L 图13.2-AB标记糖链的LC-MS分析 色谱柱： TSKgel Amide-80 2pm (2.0 mm I.D.×15 cm) 洗先 液： A：25 mmol/L 磷酸盐冲液(PH5.7) B：乙腈梯 度：75%B(0-5min)； 75-50%B (5-30 min)流 速： 0.3 mL/min温 度：40℃检 测： UV (280 nm)样 品： 2-AB 标记N型糖链(人lgG)~80pg (80%乙腈稀释)检器：(A)25荧光 ex.330nm， 420nm(B)MST， ESI positive， SIM 图15. 多克隆抗体IgG的分离 图 16.AFC法分离糖基化抗体 色谱柱： TSKgel Protein C4-300 (4.6 mm I.D. × 15 cm)洗脱 液：A：H2O/乙腈/TFA=90/10/0.05(v/v/v) B：H2O/乙腈/TFA=20/80/0.05 (v/v/v) 梯度洗脱： B0%(0min)-100%(45 min) 流速：1.0 mL/min检温进样 测： UV (215nm) 度：50℃ 样 量： 100pL 品： mAb-1， mAb-2(通过DTT还原) 谱柱： TSKgel Protein A-5PW (4.6 mm I.D.×3.5cm)E z动 相： A： 20 mmol/L 磷酸钠缓冲液(pH7.4) B： 20 mmol/L 磷酸钠缓冲液(pH2.5) 流动相切换：0-0.5分钟流动相A 0.5→1.1分钟流动相B1.1→2.0分钟流动相A(再平衡) 流 速： 2.0 mL/min 检测： UV(280nm)温进样 度： 25℃ 样 量： 20pL 品：(1)0.5 g/L IgG (溶于流动相A) (Ⅱ)含有0.5 g/L IgG的CHO细胞养养上清液 CHO 细胞培养上清液中的 IgG可在最短时间(2分钟以内)内被分离出来。 谱柱： TSKgel Boronate-5PW (7.5 mm I.D. ×7.5 cm)冲 液： A： 50 mmol/L EPPS，10 mmol/L Tris. 200 mmol/L NaCl， 0.05%NaN3B：缓冲液A+500 mmol/L山梨糖醇梯 度：0%B(0-20 min)、0→100%B(20-25min)测： UV (280 nm)度：40℃品：人单克隆抗体*B.Zhang， etal.， Anal. Chem. 2008，80，2379-2390 产品一览表(品质管理用色谱分析柱) 尺寸排阻色谱法 分析柱 货号 产品名称 粒￥径 色谱柱尺寸 分子量排阻界限(对蛋白质) TP/30 cm 0023449 TSkgel UP-SW3000 2 pm 4.6 mm l.D.x15 cm 5×105 25000* 0023448 TSKgel UP-SW3000 2 pm 4.6 mml.D. ×30 cm 5×105 45000* 0022854 TSKgel SuperSW mAb HR 4 pm 7.8 mm I.D.×30 cm 5×105 30，000 0022855 TSKgel SuperSW mAb HTP 4 pm 4.6mml.D.×15 cm 5×105 15，000 0022856 TSKgel UltraSW Aggregate 3 pm 7.8 mmI.D.x 30 cm 2.5×105 35，000 0018674 TSKgel SuperSW2000 4 pm 4.6 mm l.D.×30 cm 1×105 30000* 0021845 TSKgel SuperSW3000 4 pm 1.0 mm l.D.×30 cm 5×105 18000** 0021485 TSKgel SuperSW3000 4 pm 2.0 mm l.D. ×30 cm 5×105 25000** 0018675 TSKgel SuperSW3000 4 pm 4.6mm I.D. × 30 cm 5×105 30000* 0008540 TSKgel G2000SWxL 5 pm 7.8mmI.D. ×30 cm 1×105 20，000 0008541 TSKgel G3000SW 5 pm 7.8 mm I.D. × 30 cm 5×105 20.000 0008542 TSKgel G4000SW 8 um 7.8 mml.D. × 30 cm 7×105 16，000 出货状态：0.1 mol/L 的磷酸缓冲液 +0.1 mol/L 的硫酸钠+0.05%的叠氮钠 (pH 6.7) *使用半微量 HPLC 系统测得**使用毛细管液相系统测得注意事项：4.6mm 内径的色谱柱适用于半微量 HPLC 系统；2.0和1.0 mm内径的色谱柱适用于半微量或者毛细管液相系统。 普通液相系统可能无法发挥出 SuperSW色谱柱的最佳效果。 保护柱·填补用柱料 货号 产品名称 色谱柱尺寸 备 注 0023450 TSKgel guardcolumn UP-SW 4.6mm l.D.x 2cm UP-SW3000用 0023451 TSKgel guardcolumn UP-SW DC 4.6mml.D.× 2cm UP-SW3000用 0022857 TSKgel guardcolumn SuperSW mAb 6.0mm I.D.×： 4 cm 编号0022854用 0022858 TSKgel guardcolumn SuperSWmAb 3.0mm I.D.× 2 cm 编号0022855用 0022859 TSKgel guardcolumn UltraSW 6.0mmI.D. × 4 cm 编号0022856用 0018762 TSKgel guardcolumn SuperSW 4.6 mm I.D.×3.5 cm SuperSW 系列产品配套用 0008543 TSKgel guardcolumn SWxL 6.0mml.D.× 4 cm SWXL 系列产品配套用 *0.1 mol/L 的磷酸缓冲液+0.1 mol/L 的硫酸钠+0.05%的叠氮钠(pH 6.7) 注意事项：货号为0018762的保护柱仅适用于4.6mm 内径的 TSKgel SuperSW 系列分析柱。 离子交换色谱法 分析柱 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 离子交换容量 出货时离子对 0021961 TSKgel Q-STAT 7 um 4.6 mm I.D.×10.0 cm 270peq/g-drygel CI 0021960 TSKgel Q-STAT 10 pm 3.0mml.D.x3.5 cm 270peq/g-drygel CI 0021964 TSKgel SP-STAT 7 pm 4.6mm I.D.×10.0 cm 23peq/g-drygel Na 0021963 TSKgel SP-STAT 10 pm 3.0 mml.D.×3.5cm 23peq/g-drygel NaT 0021966 TSKgel CM-STAT 7 pm 4.6mm I.D.×10.0 cm 100peq/g-drygel Na' 0021965 TSKgel CM-STAT 10 pm 3.0mmI.D.×3.5 cm 100peq/g-drygel Na 0013075 TSKgel DEAE-NPR 2.5pm 4.6mm l.D.×：3.5cm 约0.1eq/L CI 0018249 TSKgel DNA-NPR 2.5 pm 4.6 mm I.D.× 7.5 cm 约0.1 eq/L CI 0013076 TSKgel SP-NPR 2.5 um 4.6mm l.D.×3.5cm 约0.1 eq/L Na 0021942 TSKgel SP-NPR 2.5 pm 0.3 mmI.D.×5.0 cm 约0.1 eq/L Na 出货溶剂：水 疏水色谱法 分析柱 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 官能团 孔径(nm) 0007573 TSKgel Phenyl-5PW 10 pm 7.5 mmI.D.×7.5 cm 苯基 100 0008641 TSKgel Ether-5PW 10 pm 7.5 mmI.D.×7.5 cm 低聚乙二醇 100 0014947 TSKgel Butyl-NPR 2.5pm 7.5 mm I.D.×3.5 cm 丁基 非多孔性 0042168 TSKgel Butyl-NPR 2.5 pm 4.6mm I.D.× 10 cm 丁基 非多孔性 出货溶剂：水 货号 产品名称 对应的色谱柱 0007652 TSKgel guardgel Phenyl-5PW 货号为0007573的分析柱* 0008643 TSKgel guardgel Ether-5PW 货号为0008641的分析柱* *保护柱产品套装中包括5mL装柱芯、主芯用柱套(6 mm I.D.×1cm)、预备滤纸10张和连接部件。 正相色谱法(亲水反应色谱法) 分析柱(Amide-80 2 pm) 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 出货溶剂 0023454 TSKgel Amide-80 2pm 2 pm 2.0 mm l.D.x 5.0 cm 乙腈/水=85/15 0023455 TSKgel Amide-80 2pm 2 pm 2.0 mm I.D.×10.0 cm 乙腈/水=85/15 0023456 TSKgel Amide-80 2pm 2 pm 2.0 mmI.D.×15.0 cm 乙腈/水=85/15 0023457 TSKgel Amide-80 2pm 2 pm 3.0mm l.D.×5.0 cm 乙腈/水=85/15 0023458 TSKgel Amide-80 2pm 2 pm 3.0 mml.D.×10.0 cm 乙腈/水=85/15 0023459 TSKgel Amide-80 2pm 2 pm 3.0 mm I.D.×15.0 cm 乙腈/水=85/15 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 出货溶剂 0021864 TSKgel Amide-80 3pm 3pm 2.0 mm l.D.x 5.0 cm 乙腈/水=85/15 0021865 TSKgel Amide-80 3pm 3 pm 2.0 mm I.D.×15.0 cm 乙腈/水=85/15 0021866 TSKgel Amide-80 3pm 3 pm 4.6mml.D.×5.0 cm 乙腈/水=85/15 0021867 TSKgel Amide-80 3pm 3 pm 4.6 mm l.D. ×15.0 cm 乙腈/水=85/15 分析柱(Amide-805 um) 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 出货溶剂 0019694 TSKgel Amide-80 5pm 5 pm 2.0mm I.D.× 5.0 cm 乙腈/水=75/25 0019695 TSKgel Amide-80 5pm 5 pm 2.0 mm l.D.×10.0 cm 乙腈/水=75/25 0019696 TSKgel Amide-80 5pm 5 pm 2.0 mm I.D.x 15.0 cm 乙腈/水=75/25 0019697 TSKgel Amide-80 5pm 5 pm 2.0 mmI.D.×25.0 cm 乙腈/水=75/25 0019532 TSKgel Amide-80 5pm 5pm 4.6 mml.D.×5.0cm 乙腈/水=75/25 0019533 TSKgel Amide-80 5pm 5 pm 4.6 mmI.D.×15.0 cm 乙腈/水=75/25 0013071 TSKgel Amide-80 5pm 5 pm 4.6mm l.D.×25.0 cm 乙腈/水=75/25 分析柱(Amide-80 HR 5 pm) 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 出货溶剂 0021982 TSKgelAmide-80 HR 5pm 5 pm 4.6 mm l.D.×25.0 cm 乙腈/水=85/15 货号 产品名称 色谱柱尺寸 对应的色谱柱 0023460 TSKgel guardcolumn Amide-802pm 2.0mmI.D.× 1 cm 2.0 mm和3.0mm内径的分析柱 0021862 TSKgel guardgel Amide-80 3pm 12.0mmI.D.× 1 cm 2.0mm内径的分析柱 0021863 TSKgel guardgel Amide-80 3pm 3.2 mm I.D. ×1.5 cm 4.6mm内径的分析柱 0021941 TSKgel guardgel Amide-80 5pm 2.0 mm l.D.× 1 cm 2.0mm内径的分析柱 0019010 TSKgel guardgel Amide-80 5pm 3.2mm l.D.×1.5 cm 4.6mm内径的分析柱，Amide-80HR5 pm分析斤 0019308 Cartridge holder (2.0×1用) 二 一 注意事项： TSKgel guardgel 是柱芯(一套3支)，并且需要与柱套配合使用。 分析柱(NH2-100 3 pm) 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 出货溶剂 0021967 TSKgel NH2 -100 3pm 3 pm 2.0mml.D.×5.0 cm 乙腈/水=85/15 0021968 TSKgel NH2 -100 3pm 3 pm 2.0 mm I.D.×15.0 cm 乙腈/水=85/15 0021969 TSKgel NH2-100 3pm 3 pm 4.6mm l.D.x 5.0 cm 乙腈/水=85/15 0021970 TSKgel NH2 -100 3pm 3 pm 4.6 mm I.D.× 15.0 cm 乙腈/水=85/15 保护柱和柱套 货号 产品名称 色谱柱尺寸 对应的色谱柱或柱芯 0021971 TSKgel guardgel NH2 -100 3pm 2.0mml.D.x1 cm 2.0 mm 内径的分析柱 0021972 TSKgel guardgel NH2-1003pm 3.2 mm I.D. ×1.5 cm 4.6mm 内径的分析柱 0019308 Cartridge holder (2.0×1用) 货号为0021971的柱芯 0019018 Cartridge holder (3.2×1.5用) 货号为0021972的柱芯 注意事项： TSKgel guardgel 是柱芯(一套3支)，并且需要与柱套配合使用。 反相色谱法 分析柱(Protein C4-300) 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 出货溶剂 0022830 TSKgel Protein C4-300 3 pm 2.0 mm I.D.× 5.0 cm 乙腈 0022831 TSKgel Protein C4-300 3 pm 2.0 mm I.D. ×10.0 cm 乙腈 0022832 TSKgel Protein C4 -300 3 pm 2.0 mm I.D.×15.0 cm 乙腈 0022827 TSKgel Protein C4-300 3pm 4.6 mm I.D.×5.0 cm 乙腈 0022828 TSKgel Protein C4-300 3 pm 4.6 mm I.D.× 10.0 cm 乙腈 0022829 TSKgel Protein C4-300 3pm 4.6 mm I.D. × 15.0 cm 乙腈 货号 产品名称 色谱柱尺寸 备 注 0022834 TSKgel guardgel Protein C4 2.0 mm I.D.×1cm 2.0mm I.D.色谱柱 0022833 TSKgel guardgel Protein C4 3.2 mm l.D. ×1.5 cm 3.2 mm I.D.色谱柱 0019308 2.0 mm I.D.柱芯用保护柱套 0019018 3.2 mm I.D.柱芯用保护柱套 注意事项：TSKgel guardgel 是柱芯(一套3支)， 并且需要与柱套配合使用。 亲和色谱法 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 官能团 出货溶剂 0023483 TSKgel Protein A-5PW 20 um 4.6 mm I.D. ×3.5 cm 重组 Protein A 0013066 TSKgel Boronate-5PW 10pm 7.5 mm l.D.×7.5 cm 3-氨基苯硼酸 水 *20%乙醇水溶液 色谱柱需要冷藏：TSKgel Protein A-5PW： 2~8℃、TSKgel Boronate-5PW：4~10℃ TOSOH CORPORATION BIOSCIENCE DIVISION 地址： Shiba-Koen First Bldg. 3-8-2 Shiba， Minato-Ku， Tokyo 105-8623， Japan 电话：+81-3-5427-5180传真：+81-3-5427-5220 邮箱： hlc@tosoh.co.jp 网址： www.separations.asia.tosohbioscience.com TOSOH BIOSCIENCE LLC 地址： 156Keystone Drive， Montgomeryville， PA 18936， USA 电话：+1-215-283-5000传真：+1-215-283-5035 邮箱： sales&marketing.sep@tosohbioscience.com 网址： www.tosohbioscience.com TOSOH BIOSCIENCE GmbH 地址： Zettachring 6，70567 Stuttgart， Germany电话：+49-711-13257-0传真： +49-711-13257-89邮箱： Info.sep.eu@tosohbioscience.com 网址： www.tosohbioscience.com 东曹(上海)生物科技有限公司 地址：上海市虹梅路1801号A区凯科国际大厦10楼01室 电话：+86-21-3461-0856 传真：+86-21-3461-0858 电邮： info@tosoh.com.cn 网址： www.separations.asia.tosohbioscience.com HLC、TSKgel、BioAssist、EcoSEC、Enantio、Enviropak、TOYOPEARL、TOYOPEARLMegaCap、ToyoScreen、TOYOPEARLPAK 和 TOYOPAK 均是 TOSOH公司的注册商标。 未经TOSOH公司书面同意，本产品目录中的内容不得全部或部部使用或复制。 产品目录的内容可能会随时发生更改，恕不另行通知。 TOSOH公司版权所有 。 抗体是一种结构复杂的生物大分子，由多个氨基酸组成。即便是天然的抗体，其结构也是各不相同。抗体药物中使用到的单克隆抗体(IgG)在生产工艺(细胞培养、分离纯化)与保存过程中易发生不均一性的变化，包括抗体蛋白的二聚体、多聚体、脱酰胺化、末端氨基酸突变以及糖链部分的结构差异。这些不均一性会使药物的药效、安全性方面受到影响。     而随着生产工艺及分析手段的进步，单克隆抗体类药物的质量控制将更加严格。高效液相色谱(HPLC)作为一种分离技术，在蛋白质、抗体等生物大分子的分离分析方面已得到越来越广泛的应用。近年来，东曹生物的科学家们一直致力于在生物药分离领域开发具有革新性的色谱分离介质，基于尺寸排阻、离子交换色谱等多种HPLC分离技术实现了对抗体多聚体、各种抗体异构体的高效分离，在抗体药物的质量控制方面提供了有效地监控手段。