ADC中DAR分布检测方案(液相色谱柱)

-分析 应用笔记 尺寸排阻色谱法(SEC))及疏水色谱法(HIC)表征新颖的ADC药物模拟物 抗体偶联药物(ADC)作为一种生物治疗候选药物是近年来的研究热点。ADC药物是将单克隆抗体的肿瘤特异性和靶向性与高效的小分子药物的细胞毒性结合成一个新的药物分子，从而形成有效的抗癌治疗剂。这些分子由三部分组成：单克隆抗体、稳定的连接物以及细胞毒性小分子药物。本研究中使用的半胱氨酸偶联的ADC模拟物，通过LC-SMCC交联剂将丹磺酰基基光团(~668Da) 共价键合到IgG1-mAb (150kDa)上(图1)，从而形成一个载药量不同(0-8)的抗体混合物(图2)。O ADC药物的药效和清除率都与DAR值相关，因此在药物开发过程中务必很好地理解其特性。 半胱氨酸偶联的ADC模拟物 图1 尺寸排阻色谱法(SEC)和疏水色谱法(HIC)是在天然生理条件下表征药物/抗体比(DAR)的两种最常用的技术。在本文中， SEC/MS分析法使用了TSKgelSuperSW3000色谱柱， HIC法使用了TSKgel Butyl-NPR色谱柱来对ADC模拟物进行分析。结合使用以上色谱技术，可以有效阐明和验证该生物分子模型的DAR谱图。 HPLC实验条件 SEC/MS条件 色谱柱： TSKgel SuperSW3000， 4 pm， 2 mm ID × 30 cm流动相： 100 mmol/L醋酸铵， pH7.0梯度： 等度流速： 0.07 mL/min检测： ESI-MS温度： 35℃进样量： 1.0pL样品： ADC模拟物，100 pg/mL (MilliporeSigmaTM)，100 mmol/L醋酸铵， pH 7.0 MS模式： 扫描， m/z 1000-8000 HIC/UV条件 色谱柱： TSKgel Butyl-NPR， 2.5 um， 4.6 mm ID× 10 cm 流动相： A. 50 mmol/L磷酸钾，1.5 mol/L硫酸铵， pH 7.0添加5%(v/v)异丙醇B. 50 mmol/L磷酸钾，pH 7.0添加20%(v/v)异丙醇梯度： 0%B至100%B，50分钟流速： 1.0 mL/min检测： UV @ 215 nm温度： 35℃进样量： 5.0 pL样品： ADC模拟物， 100 pg/mL (MilliporeSigma)， 100 mmol/L醋酸铵， pH 7.0 半胱氨酸偶联的ADC的异质性 图2 将ADC模拟物注入TSKgel SuperSW3000 SEC色谱柱， HPLC系统与质谱仪相连，用于检测DAR谱图。图3显示了ADC模拟物的去卷积质谱图。在m/z 143，799、145，135、146，474、147，812及149，147 处可观察到主峰。每个主峰之间的分子量差异为1336 Da， 对应两个丹磺酰基荧光团分子的分子量。平均DAR为3.9。 ADC模拟物的SEC/MS谱图 图3 然后使用TSKgel ButyI-NPR色谱柱和UV检测，通过HIC法可确认DAR分布情况。mAb抗体结合的药物分子数越多， ADC越具有疏水性，且在HIC固定相中可保留更长时间，使得载药量不同的组分得到分离。图4显示了ADC模拟物的DAR谱图，可以看到在DAR=0-8的峰之间分离很好。 3 洗脱顺序： 1) DAR0(天然mAb) 2)DAR 2 3) DAR 4 4) DAR 6 图4 结论 SEC/MS和 HIC/UV可以有效表征ADC的 DAR谱图。在TSKgel SuperSW3000 SEC色谱柱上使用了一种非变性条件下质谱兼容的流动相，并通过高分辨率ESI-MS检测验证了药物模拟物中ADC组分的分子量。SEC/MS分析表明，平均DAR为3.9。使用TSKgel ButyI-NPR色谱柱对样品中各种抗体-载荷的ADC异构体进行疏水性分析，进一步确认了其DAR分布。通过HIC/UV分析已证实平均DAR为3.9. ( 数据由Millipor e Sigma提供： ) ( Cory E . Muraco1， K evin Ray2， G ary Od e n1， a n d Dave Bell1 ) ( 1 M i l li poreSig m a， 595 North Harrison Rd. B ellef o nte， P A 1 6 823 ) ( 2 MilliporeSigm a ， 2909 L a clede Ave.St. L ouis， M O 63103 )         SEC-MS和HIC-UV是表征ADC药物DAR分布最常用的两种方法。在本解决方案中，SEC使用了TSKgel SuperSW3000色谱柱，在该色谱柱中使用一种非变性条件下质谱兼容的流动相，通过高分辨率ESI-MS检测，验证药物模拟物中ADC组分的分子量。HIC-UV方法中使用的是疏水色谱柱TSKgel Butyl-NPR，对样品中各种抗体-载荷的ADC异构体进行疏水性分析。        结合使用这两种分析技术，可以有效验证ADC生物大分子的DAR谱图。