单克隆抗体中糖基化修饰检测方案(液相色谱柱)

一分析图1 应用笔记 采用HILIC色谱柱TSKgel Amide-80 2um进行UHPLC糖基化分析 糖基化是蛋白质翻译后修饰的最常见的类型之一。多糖侧链(聚糖)在免疫细胞信号传导的生理、病理现象中起着重要作用。除了对糖蛋白的糖基化模式进行结构/功能上的分析外，糖基化的全面表征也是生物药物生产中的一个主要的质量参数。亲水相互作用色谱法(HILIC)一直以来都是公认的有效分离和定量游离聚糖的分析方法。 autoGU)预测聚糖结构。 糖蛋白分析包括对N-糖链结构和O-糖链结构的表征。除质谱技术外，利用酰胺固定相的HILIC法高分辨率分离糖蛋白的N-聚糖，是许多实验室常用的一种成熟稳定的分析技术。通过2-AB或PA等荧光试剂标记聚糖，可以进行飞摩尔水平的糖的检测。 最新的TSKgel Amide-80 (2um)色谱柱由2 um粒径的硅胶颗粒充填，这些硅胶颗粒与氨基甲酰基团共价键合。多年来，3 pum或5 pm的TSKgel Amide-80色谱柱已经被许多QC实验室用来分析糖类物质。最新的2 um Amide-80色谱柱也具有相同的分离选择性，并且可以提高(U) HPLC和LC-MS分析的峰容量和灵敏度，因此可将HPLC分析方法顺利转移至UHPLC。此款色谱柱特别适用于UHPLC系统，因其拥有2 um的小粒径有助于减少系统死体积、优化检测器灵敏度，可以获得更高分辨率的分离效果。 结果与结论 TSKgel Amide-80色谱柱的化学特性使其能够在单次色谱运行中分离中性聚糖和带电聚糖。将TSKgelAmide-80色谱柱上标记多糖的保留时间与标记葡聚糖同聚物梯度进行比较，可以识别聚糖结构，计算出聚糖的葡萄糖单元值(GU值)。对外切糖苷酶消化物进行分离后获得的GU值通过查询聚糖数据库 (Glycobase， 如图1所示，新型的2 um TSKgel Amide-80色谱柱对PA-聚糖的分辨率比3 pm色谱柱提高了1.4倍。在0.5mL/min的流速条件下，最大压降不超过55 MPa。图2和图3分别是采用荧光检测和质谱检测对标记的聚糖进行糖基化分析的结果。2 pm TSKgel Amide-80色谱柱适用于大多数单克隆抗体糖基化分析。 TSKgel Amide-80 2 um 和3um的比较 ：LC-MS分析： 色谱柱： TSKgel Amide-80 2 um (2.0 mm IDx15 cm) 流动相： A： 50 mmol/L HCOONH4， pH 7.5 B：乙腈 梯度： 75%B(0~5分钟)， 75%~50%B(5~30分钟，线性) 流速： 0.3 mL/min 温度： 40℃ 检测： (a)荧光 (EX@315nm， EM@ 380 nm) (b)LC/MS， ESI阳性， SIM (Shimadzu LCMS-8030) 进样量： 50 pL 样品： 从人IgG释放的2-AB标记的N-聚糖 (Ludger， cat.#CLIBN-IGG-01) 使用TSKgel Amide-802 pm色谱柱进行的抗体糖基化分析 图2 使用TSKgel Amide-80 2 um色谱柱进行的2-AB糖原UHPLC-MS分析     TSKgel Amide-80系列亲水相互作用色谱柱能够在单次色谱运行中分离中性聚糖和带电聚糖，该系列色谱柱已经被许多QC实验室用来分析糖类物质。新开发的2um粒径的TSKgel Amide-80色谱柱提高了(U)HPLC和LC-MS分析的峰容量和灵敏度，可将HPLC分析方法顺利转移至UHPLC。并有助于减少系统死体积、优化检测器灵敏度，获得更高分辨率的分离效果。    本文中介绍了使用TSKgel Amide-80 2um色谱柱，通过荧光检测和质谱检测对标记的聚糖进行糖基化分析的实例。结果表明，2um TSKgel Amide-80色谱柱适用于大多数单克隆抗体糖基化分析。