抗体药物中二硫键解析检测方案(液质联用仪)

聂爱英 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 Q-Exactive； BioPharma Finder；单抗；；二硫键解析 1.前言 目前，在全球范围内，单克隆抗体药物已经成为生物医药领域中最耀眼的一颗明珠。该类抗体药物具有靶向性专一、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药物治疗领域的最新发展方向，并且在抗肿瘤和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了强有力的推广。我国的抗体药物产业也在如火如荼的进行中，在抗体药物的前期研发和生产质控过程中，抗体药物的完整分子质量、轻重链分子质量、肽图、糖链、二硫键等结构特征信息需要进行严格、快速的监测和质控，从而保证抗体药物的有效性和安全性。 其中，二硫键作为共价键交联多肽链内或链间的两个半胱氨酸，对于稳定蛋白质的空间结构、维持正确的空间折叠构象、保持及调节其生物活性等都起着举足轻重的作用，尤其对于生物药品，二硫键的位置和连接情况对于生物药物的空间结构、药物活性等起着关键的作用。X射线衍射晶体结构解析法、多维核磁共振法、二硫键异构及突变分析法、酶解法和化学裂解法等方法都可以用于二硫键定位分析，但这些方法普遍存在检测速度慢、样品要求纯度高、人工操作复杂等局限性，不过，随着质谱仪器在质量检测范围、分辨率、灵敏度、准确度和分析速度等方面的不断提高，使得质谱分析法已经可以简单、快速的应用于二硫键的定位分析中，不仅可以实现已知二硫键的确认，而且还可以实现未知二硫键的发现和鉴定，远远优于其它检测方法。 目前，基于先进的四级杆技术和超高场 Orbitrap 质量分析器的 Q-Exactive HF 仪器平台，可以为生物制药分析提供更加快速、灵敏、准确的二硫键、分子量、肽图、糖链等重要信 息。同时，由国际领先生物制药公司 Amgen 和 Thermo Fisher共同开发的，为生物制药公司量身定做的BioPharma|Finder生物制药软件，可以为生物制药客户提供抗体药物相关的二硫键、分子量、肽图、糖链、氨基酸突变位点以及各种后修饰位点等的定性和定量信息。在这里我们主要介绍基于 Q-ExactiveHF 仪器平台和 BioPharma Finder 生物制药软件的简单、快速的抗体药物二硫键解析。 2.1仪器和试剂 质谱仪器： Q-Exactive HF (赛默飞世尔科技，美国)； 色谱仪器： Easy Nano1000液相色谱系统(赛默飞世尔科技，美国)； 色谱柱：自制反相 Nano 色谱柱(C18， 2pm， 75×150 pm， 100A)； 试剂：色谱级甲酸、二二次去离子水，色谱级乙腈，盐酸胍 (Sigma-Aldrich，美国)，碳酸氢铵 ( Sigma-Aldrich，美国)， Trypsin (Promega， 美国)。 2.2样品前处理 IgG1 类型的单抗药物置于6M盐酸胍体系中，室温变性1小时，使用超滤管进行溶液体系置换，终溶液为50mM 碳酸氢铵，然后加入 Trypsin、酶和蛋白的质量比为 1：40， 37 度过夜酶切，加入1%甲酸终止酶切，旋转冻干，备用。 (变性时间和酶解时间可以根据样品的不一致性进行相应调整) 2.3 仪器方法 色谱分析条件：具体见表1； 质谱分析条件：具体见表2； 2.4数据分析方法 使用 BioPharma Finder 1.0软件对原始谱图进行二硫键分析，数据库为抗体药物对应的氨基酸序列，搜库参数基本使用软件的默认设置，勾选二硫键搜索，无需指定二硫键可能的链接位置，如图1所示。 表1.二硫键分析的色谱条件 流速 色谱梯度 B：0.1%甲酸的乙腈溶液 300 nL/min 时间/min B相浓度/% 3 4 8 45 22 53 30 57 90 60 90 表2.二硫键分析的质谱条件 喷雾电压 2.0 kV 毛细管加热温度 275℃ S-lens 60%： ·级扫描分辨率 60000 ·级质量扫描范围 m/z350-2000 二级扫描分辨率 15000 二二级质量扫描范围 start from m/z120 级 AGC Target 3e6 二级 AGC Target 1e5 -级 Maximum IT 20 ms 二级Maximum IT 60 ms 图1. BioPharma Finder 1.0 软件中二硫键设置模块 3.结果与讨论 现在商业化最多的单克隆抗体为 lgG1类型的单抗药物，该类型的抗体中，主要存在16对二硫键，其中重链内部有8对，轻链内部有4对，轻链和重链链间有2对，重链链间有2对，考虑到单抗结构的对称性，最终，非冗余的二硫键共9对。以正在测试的单抗药物为例，理论二硫键的连接情况如图1 所示。 的位置 图1.lgG1类型单抗药物的二硫键连接形式以及正在测试的单抗药物的理论二硫键的具体连接信息。 得益于 Q-Exactive HF 的超高灵敏度、超高质量精度和超快采集速度，该测试抗体药物的9对二硫键连接形式仅在Trypsin 酶解的肽段产物中就都得到了100%的鉴定覆盖，充分体现出Q-Exactive HF 的强大定性能力。 首先以重链中 HC22-HC96 的二硫键连接为例，如图2所示，肽段AEDTAVYYCAK 和 LSCAASGFTFDDYAMHWVR的二级碎片信息非常丰富，同时一级母离子的质量偏差在1.58 ppm， 因此可以准确、快速的确定二硫键的连接情况。 图2.肽段 AEDTAVYYCAK 和 LSCAASGFTFDDYAMHWVR (HC22-HC96)的二硫键连接二级碎片谱图 其次，以轻链中LC23-LC88的二硫键连接为例，如图3所示， 肽段 VTITCR 和 FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQR的二级碎片信息也非常丰富，同时一级母离子的质量偏差在1.73 ppm， 因此可以准确、快速的确定二硫键的连接情况。 图 3.肽段 VTITCR 和 FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQR(LC23-LC88)的二硫键连接二级碎片谱图 最后，以重链铰链区的两对相近的二硫键 HC230-HC230和HC233-HC233为例，如图4所示， 肽段 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 和 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK的二级碎片信息也非常丰富，同时一级母离子的质量偏差在1.70 ppm， 因此可以准确、快速的确定这两对二硫键的连接情况。 Orbitrap组学俱乐部 赛默飞小分子质谱应用技术群 图 4.肽段 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 和 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK (HC230-HC230 和HC233-HC233)的二硫键连接二级碎片谱图 4.结论 本文基于 Q-Exactive 仪器平台和 BioPharma Finder 数据分析软件，实现了单抗药物简单、快速的二硫键解析，为单抗药物的初期研发和生产质控提供了高效、可靠的分析测试方法。除此之外， Q-Exactive 系列的质谱仪器，凭借其超高的分辨率、超快的扫描速度和超高的质量精度，必将助力于生物制药行业的深度质谱分析。 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com 全国服务热线：80081051184006505118(支持手机用户) AN_C_LCMSMS_28_201603Y SCIENTIFIC AThermo Fisher Scientific Brand