单克隆抗体中电荷异质性分析检测方案(液相色谱柱)

分析 应用笔记 使用离子交换色谱柱快速分析IgG电荷异质性 考察强、弱阳离子交换色谱柱，，以及流动相pH值对其分离状况的影响 治疗性抗体药物市场正进入快速增长期。2013年，全球十大畅销药物品牌中有六个是单克隆抗体(mAb)药物。在过程监控和质量控制中需要对多聚体和片段的含量、糖基化模式和带电异构体等这些主要产品特性进行检测。本文使用了阳离子交换色谱柱TSKgel STAT对mAb电荷异质性进行了快速分析。 简介 天冬酰胺或谷氨酰胺残基的脱酰胺作用，或者C末端赖氨酸残基的缺失都会导致蛋白质电荷异构体的产生。除等电聚焦外，离子交换色谱法是分析蛋白质电荷异质性的首选方法。TSKgel STAT色谱柱装填的是无孔聚合物基质固定相，专利的表面改性技术确保了颗粒表面覆盖有高密度的带电基团。与传统的多孔型IEX固定相相比，STAT色谱柱可以在较短的分析时间内进行高分辨率的分析。 TSKgel STAT色谱柱系列产品既包括弱阳离子交换剂(WCX，羧甲基)，也包括强阳离子交换剂(SCX，磺丙基)。建议与死体积较小的色谱系统(例如UHPLC)配合使用，，可以发挥最佳性能。 pH 7.0条件下强/弱阳离子交换柱上mAb A的分析 使用弱阳离子交换色谱柱TSKgel CM-STAT和强阳离子交换换谱柱TSKgel SP-STAT， 对两种单克隆抗本的电荷异构体进行了分析。图1显示的是在pH7条件下两根色谱柱上对mAbA的分析结果。对于该IgG，弱阳离子交换色谱柱可以更好地将异构体从主峰中分离出来。mAb B的情况则与之不同，如图2所示，强阳离子交换色谱柱表现出了更好的分离性能。图3是TSKgel SP-STAT对mAb B的分离情况，可以看出流动相的pH值会影响电荷异构体的保留时间和分离度。 讨论 强、弱阳离子交换色谱柱为分析蛋白质电荷异质性提供了不同的选择。为了将酸性和碱性异构体从主峰上更好地分离出来，在方法开发时应在不同pH值流动相条件下评估两种色谱柱的分离性能。TSKgel STAT系列色谱柱能够在短时间内高分辨率分离异构体，非常适合用在UHPLC或HPLC系统上对生物药进行质控分析。 pH 7.0条件下强/弱阳离子交换柱上mAb B的分析 实验条件 色谱柱： TSKgel SP-STAT (7 pm， 4.6 mm IDx10 cm)； TSKgel CM-STAT (7 um， 4.6 mm IDx10 cm) 流动相 A： 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液 pH7.0(图1、2、3) pH7.0(图1、2、3) 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液 pH 6.0 (图3) 流动相 10 mmol/L醋酸盐缓冲溶液 pH 5.0 (图3) B： 100 mmol/L磷酸盐缓冲溶液 pH 7.0 + 500 mmol/L NaCl(图1、2、3) 100 mmol/L磷酸盐缓冲溶液， pH 6.0 + 500 mmol/L NaCl (图3) 100 mmol/L醋酸盐缓冲溶液， pH 5.0 + 500 mmol/L NaCl (图3) 梯度： 50分钟内0~100%B 50分钟内0~100%B 流速： 1 mL/min 进样量： 10pL 检测： UV@280 nm 样品： mAb A (2 g/L)； mAb B (2 g/L) 阳离子交换分离状况与流动相pH值的关系考察 图3 本应用中，使用了东曹的两款强、弱阳离子交换色谱柱TSKgel SP-STAT和TSKgel CM-STAT，对单克隆抗体IgG的电荷异质性进行快速分析，并考察了流动相pH值对其分离情况的影响。实验结果表明，TSKgel SP-STAT和CM-STAT这两款阳离子交换色谱柱，给蛋白质电荷异质性分析提供了不同的选择。在方法开发时，为了将酸性和碱性异构体从主峰上更好地分离出来，应在不同pH值流动相条件下评估两种色谱柱的分离性能。