抗体中结合试验检测方案(酶标仪)

ThermoFisherSCIE NTIFIC 从原理来看，这类实验主要分为两类，第一类是基于靶点特异性结合的抗体结合实验，这类方法主要研究抗体与靶点直接的特异性结合能力，研究方法分别有依赖于固相介质的ELISA，均相溶液中的靶点结合检测，以及细胞水平的流式分析；另一类是基于配体阻断结合的抗体结合实验，这类实验主要研究抗体与配体竞争结合受体的情况，通过比较抗体与配体结合受体的亲和力差异，来评价抗体与靶点的结合位点和结合能力。 Tabrizi， Mohammad A.； Bornstein， Gadi G.； Klakamp， Scott L. (2012).Development of Antibody-Based Therapeutics.，10.1007/978-1-44195955-3()，-.doi：10.1007/978-1-4419-5955-3 我们可以通过具体实验来研究上述机理。首先，对于基于靶点特异性结合的抗体结合实验，最常用的是基于固相的间接ELISA和基于细胞水平的流式分析法，间接ELISA是利用酶标记的抗抗体来检测已与固相结合的受检抗体，该实验的成功关键点在于包被抗原的合理选择，封闭试剂的体系优化，检测二抗需要在保障高度特异性同时，避免种属cross反应，另外通过选择更灵敏的显色方法并使分析范围最大化。 抗体结合实验分析一间接ELISA法(Multiskan SkyHigh全波长酶标仪、Multiskan FC酶标仪、Wellwash洗板机) 实验成功关键点： 。包被抗原的选择(浓度，纯度，有效表位) .·封闭试剂的选择(BSA， milk，以及表面活性剂选择，避免封闭不足或封闭过度) ·检测二抗的选择(在保障高度特异性同时，避免种属cross 反应) ·选择更灵敏显色方法使分析范围最大化 选择biotin的二抗+streptavidin-HRP 选择更灵敏的TMB 可获得更大的筛选窗口 那么流式检测与间接ELISA的差异主要在于细胞水平上的抗原抗体结合具有空间结构的选择性，其成功的关键点在于合理选择天然或构建功能细胞株，更能有效模拟真实生理现象；除此之外，有效地流式操作流程和体系建立也至关重要，包括样品制备到buffer，功能试剂的选择，检测抗体的特异性，背景以及对照体系等等；比如，如果实验中我们的功能细胞株带有Fc受体，就需要加入Fc封闭试剂类的辅助试剂来降低背景，提高实验结果精确性。 抗体结合实验分析分流式法(Attune NxT流式细胞仪) 实验成功关键点： ·功能细胞株选择(天然细胞株，构建细胞株) ·Staining Buffer的选择 (BSA， FBS，EDTA等) ·检测抗体的选择(特异性，背景) Fc受体为对免疫球蛋白Fc部分c末端的受体Mouse lgG2a K Isotype ControlIFITTC， U937 cell line 以下类型细胞易出现高背景： 人：骨髓细胞、粒细胞和B细胞 小鼠：B细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细 胞、中性粒细胞 紫色-没有Fc封闭试剂 另外关于基于配体阻断结合的抗体结合实验，实验中经常会需要对其中一个组分，比如待测抗体或竞争配体进行生物素化或荧光等活性标记，从而获得可量化的高灵敏度信号来进行亲和力差异比较。 相对竞争法FACS测抗体流程 60000 40000 20000 conrer PBS 首先，对于基于靶点特异性结合的抗体结合实验，最常用的是基于固相的间接ELISA和基于细胞水平的流式分析法，间接ELISA是利用酶标记的抗抗体来检测已与固相结合的受检抗体，该实验的成功关键点在于包被抗原的合理选择，封闭试剂的体系优化，检测二抗需要在保障高度特异性同时，避免种属cross反应，另外通过选择更灵敏的显色方法并使分析范围提高。抗体结合实验分析—间接ELISA法（Multiskan SkyHigh全波长酶标仪、Multiskan FC酶标仪、Wellwash洗板机）那么流式检测与间接ELISA的差异主要在于细胞水平上的抗原抗体结合具有空间结构的选择性，其成功的关键点在于合理选择天然或构建功能细胞株，更能有效模拟真实生理现象；除此之外，有效地流式操作流程和体系建立也至关重要，包括样品制备到buffer，功能试剂的选择，检测抗体的特异性，背景以及对照体系等等；比如，如果实验中我们的功能细胞株带有Fc受体，就需要加入Fc封闭试剂类的辅助试剂来降低背景，提高实验结果精确性。抗体结合实验分析—流式法（Attune NxT流式细胞仪） 另外关于基于配体阻断结合的抗体结合实验，实验中经常会需要对其中一个组分，比如待测抗体或竞争配体进行生物素化或荧光等活性标记，从而获得可量化的高灵敏度信号来进行亲和力差异比较。更多详情请点击“下载”按钮