在单克隆抗体药物的初期研发阶段中,需要对细胞株进行筛选,选出能产生滴度较高、ADCC活性较高的细胞株。东曹公司推出的新型亲和色谱柱FcR-IIIA-NPR能?够基于抗体糖链结构的差异,对细胞培养液中的抗体进行HPLC分析,将繁琐的抗体生物学活性测定法化繁为简,获得重复性良好的分析结果。
细胞株筛选用色谱柱 TSKgel FcR-IIIA-NPR 基于糖链结构的差异,对细胞培养液中的抗体进行 HPLC 分析 在单克隆抗体药物的初期研发阶段中,通过对细胞株 (cell line)实施筛选,选出能产生滴度较高、ADCC 活性较高的细胞株。此时常会用到的几种评估方法是,通过生物检定法测定 ADCC 活性;通过表面等离子共振法(SPR)测定人体 IgG受体(FcyRllla等)的亲和力;通过 LC/MS 分析抗体酶切下来的糖链结构等,但是这些方法都需要花费大量的时间和人力。能够把这些复杂的评估分析法由繁化简,并快速完成分析的 HPLC 色谱柱就是 TSKgelFcR-IIIA-NPR。 使用 TSKgel FcR-IIIA-NPR,可以直接分离抗体,无需对细胞培养液进行前处理。抗体主要可以分离出3个洗脱峰。已有研究表明,抗体糖链末端的半乳糖数量越多,在此色谱柱中的保留能力越强,而保留能力越强的洗脱峰,其 ADCC 活性就越高1)-3)。 细胞培养液中单克隆抗体的分离 色谱柱: TSKgel FcR-IIIA-NPR (4.6 mm I.D. x7.5 cm)洗脱液:缓冲溶液A: 50 mM Citrate, 150 mM NaCl pH6.5缓冲溶液 B: 50mM Citrate, 150 mM NaCl pH4.5度:EB 0%(0-7min)) B 0-100%(7-25 min)B 100%(25-30 min) B 0%(30-35 min)流速:1.0mL/min,温度:20℃,检测: UV(280 nm)样品:细胞培养液(含抗体) ※ 色谱分析时,在洗脱液中添加 150 mM NaCl, 可以提高抗体与杂质的分离效果。 主要的分析用途(通过色谱谱图以确认抗体糖链结构的变化) 确认不同细胞株 (CHO 细胞、HEK细胞等)中抗体的性状变化确认多个细胞株筛选时抗体的性状变化 .确认当改变细胞培养基添加剂时抗体的性状变化 细胞培养过程中随培养天数的变化导致抗体性状变化的确认 细胞培养规模放大(更改培养方法)时,确认抗体是否发生性状变化 ( 参考文献: ) ( 1) M. Kiyoshi et al., Assessing the Heterogeneity of the Fc-Glycan of a Therapeutic Antibody Using an Engineered FcyReceptor Illa-immobilized Column, Scientific Reports, 2018,8:3995. ) ( 2) R. Wada et al., Influence of N-glycosylation on effector functions and thermal stability of glycoengineer e d Ig G 1 monoclonal antibody with homogeneous glycoforms, MAbs. 2019 F e b/Mar; 11 ( 2):350-372. ) ( 3) Tosoh Bioscience, Characterization o f TSKgel FcR-IIIA-N P R HPLC Column by Top Down Mass Spectrometry, LCGC North America, 3 7 (2)(2019) p142-144. ) 抗体(Biosimilar)细胞培养时的培养天数和产生抗体的变化 取不同培养天数的细胞培养液,使用 Protein A 填料对抗体样品粗纯后,再采用 TSKgel FcR-IIIA-NPR 色谱柱分析的结果如下图所示。 随着培养天数的延长,抗体的3个洗脱峰会向前侧的洗脱峰位移。从下图中可以看出,虽然延长了细胞培养天数,抗体的绝对产量增加,但是由于受到细胞外糖链修饰酶的影响,在色谱柱中的保留能力较高的抗体(多糖的末端半乳糖数量较多的抗体)的洗脱峰反而减少了。因此,,可以推定产生的抗体的 ADCC 活性已经降低。 如上所述,只要使用 TSKgel FcR-IIIA-NPR色谱柱,即可轻松测定和监控细胞培养时抗体糖链的性状变化。 <分析条件>色谱柱:TSKgel FcR-IIIA-NPR (4.6 mmI.D.×7.5 cm)洗脱液 A: 50 mmol/L 柠檬酸缓冲溶液(pH6.5)B: 50 mmol/L柠檬酸缓冲溶液(pH4.5) 梯 度:B0-100%(2-20min,线性) 流 速:1.0mL/min 检 测:UV(280nm) 温 度:25℃ 样 品:单克隆抗体 样 品: mAb、5 ug *开始培养并经过一定时间后,采集 CHO细胞培养液,过滤后用 Protein A填料纯化并测定 ·TSKgel FcR-IIIA-NPR产品一览表 货号 产品名称 粒径(um) 色谱柱尺寸 备注 0023513 TSKgel FcR-IIIA-NPR 5 4.6 mm I.D.×7.5cm 根据抗体的 Fc 糖链结构进行分离 0018014 在线过滤器套件 PEEK - TSKgel FcR-IIIA-NPR专用(替代保护柱) TOSOH 东曹(上海)生物科技有限公司 电话:021-34610856 传真:021-34610858 E-mail: info.tbs@tosoh.com.cn 网址: www.separation.asia.tosohbioscience.com 在单克隆抗体药物的初期研发阶段中,需要对细胞株进行筛选,选出能产生滴度较高、ADCC活性较高的细胞株。东曹公司推出的新型亲和色谱柱FcR-IIIA-NPR能够基于抗体糖链结构的差异,对细胞培养液中的抗体进行HPLC分析,将繁琐的抗体生物学活性测定法化繁为简,获得重复性良好的分析结果。
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202211/pic/e07ddcb1-29c2-4379-840e-d9ba0f9f8579.jpg)
还剩1页未读,是否继续阅读?
东曹(上海)生物科技有限公司为您提供《单克隆抗体中含量分析检测方案 》,该方案主要用于预防类生物药品中含量测定检测,参考标准--,《单克隆抗体中含量分析检测方案 》用到的仪器有TSKgel FcR-ⅢA-NPR高性能亲和色谱柱