单克隆抗体中含量分析检测方案

细胞株筛选用色谱柱 TSKgel FcR-IIIA-NPR 基于糖链结构的差异，对细胞培养液中的抗体进行 HPLC 分析 在单克隆抗体药物的初期研发阶段中，通过对细胞株 (cell line)实施筛选，选出能产生滴度较高、ADCC 活性较高的细胞株。此时常会用到的几种评估方法是，通过生物检定法测定 ADCC 活性；通过表面等离子共振法(SPR)测定人体 IgG受体(FcyRllla等)的亲和力；通过 LC/MS 分析抗体酶切下来的糖链结构等，但是这些方法都需要花费大量的时间和人力。能够把这些复杂的评估分析法由繁化简，并快速完成分析的 HPLC 色谱柱就是 TSKgelFcR-IIIA-NPR。 使用 TSKgel FcR-IIIA-NPR，可以直接分离抗体，无需对细胞培养液进行前处理。抗体主要可以分离出3个洗脱峰。已有研究表明，抗体糖链末端的半乳糖数量越多，在此色谱柱中的保留能力越强，而保留能力越强的洗脱峰，其 ADCC 活性就越高1)-3)。 细胞培养液中单克隆抗体的分离 色谱柱： TSKgel FcR-IIIA-NPR (4.6 mm I.D. x7.5 cm)洗脱液：缓冲溶液A： 50 mM Citrate， 150 mM NaCl pH6.5缓冲溶液 B： 50mM Citrate， 150 mM NaCl pH4.5度：EB 0%(0-7min)) B 0-100%(7-25 min)B 100%(25-30 min) B 0%(30-35 min)流速：1.0mL/min，温度：20℃，检测： UV(280 nm)样品：细胞培养液(含抗体) ※ 色谱分析时，在洗脱液中添加 150 mM NaCl， 可以提高抗体与杂质的分离效果。 主要的分析用途(通过色谱谱图以确认抗体糖链结构的变化) 确认不同细胞株 (CHO 细胞、HEK细胞等)中抗体的性状变化确认多个细胞株筛选时抗体的性状变化 .确认当改变细胞培养基添加剂时抗体的性状变化 细胞培养过程中随培养天数的变化导致抗体性状变化的确认 细胞培养规模放大(更改培养方法)时，确认抗体是否发生性状变化 ( 参考文献： ) ( 1) M. Kiyoshi et al.， Assessing the Heterogeneity of the Fc-Glycan of a Therapeutic Antibody Using an Engineered FcyReceptor Illa-immobilized Column， Scientific Reports， 2018，8：3995. ) ( 2) R. Wada et al.， Influence of N-glycosylation on effector functions and thermal stability of glycoengineer e d Ig G 1 monoclonal antibody with homogeneous glycoforms， MAbs. 2019 F e b/Mar； 11 ( 2)：350-372. ) ( 3) Tosoh Bioscience， Characterization o f TSKgel FcR-IIIA-N P R HPLC Column by Top Down Mass Spectrometry， LCGC North America， 3 7 (2)(2019) p142-144. ) 抗体(Biosimilar)细胞培养时的培养天数和产生抗体的变化 取不同培养天数的细胞培养液，使用 Protein A 填料对抗体样品粗纯后，再采用 TSKgel FcR-IIIA-NPR 色谱柱分析的结果如下图所示。 随着培养天数的延长，抗体的3个洗脱峰会向前侧的洗脱峰位移。从下图中可以看出，虽然延长了细胞培养天数，抗体的绝对产量增加，但是由于受到细胞外糖链修饰酶的影响，在色谱柱中的保留能力较高的抗体(多糖的末端半乳糖数量较多的抗体)的洗脱峰反而减少了。因此，，可以推定产生的抗体的 ADCC 活性已经降低。 如上所述，只要使用 TSKgel FcR-IIIA-NPR色谱柱，即可轻松测定和监控细胞培养时抗体糖链的性状变化。 <分析条件>色谱柱：TSKgel FcR-IIIA-NPR (4.6 mmI.D.×7.5 cm)洗脱液 A： 50 mmol/L 柠檬酸缓冲溶液(pH6.5)B： 50 mmol/L柠檬酸缓冲溶液(pH4.5) 梯 度：B0-100%(2-20min，线性) 流 速：1.0mL/min 检 测：UV(280nm) 温 度：25℃ 样 品：单克隆抗体 样 品： mAb、5 ug *开始培养并经过一定时间后，采集 CHO细胞培养液，过滤后用 Protein A填料纯化并测定 ·TSKgel FcR-IIIA-NPR产品一览表 货号 产品名称 粒径(um) 色谱柱尺寸 备注 0023513 TSKgel FcR-IIIA-NPR 5 4.6 mm I.D.×7.5cm 根据抗体的 Fc 糖链结构进行分离 0018014 在线过滤器套件 PEEK - TSKgel FcR-IIIA-NPR专用(替代保护柱) TOSOH 东曹(上海)生物科技有限公司 电话：021-34610856 传真：021-34610858 E-mail： info.tbs@tosoh.com.cn 网址： www.separation.asia.tosohbioscience.com 在单克隆抗体药物的初期研发阶段中，需要对细胞株进行筛选，选出能产生滴度较高、ADCC活性较高的细胞株。东曹公司推出的新型亲和色谱柱FcR-IIIA-NPR能够基于抗体糖链结构的差异，对细胞培养液中的抗体进行HPLC分析，将繁琐的抗体生物学活性测定法化繁为简，获得重复性良好的分析结果。