疫苗中4种防腐剂残留检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA22-012Excellence in Science Excellence in ScienceLC-271 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 液相色谱法检测疫苗中四种常见防腐剂残留 LC-271 摘要：本文建立了一种使用液相色谱仪检测疫苗中苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇、羟苯甲酯防腐剂残留的方法。样品经乙腈沉淀蛋白，离心滤过后上机分析。实验结果显示：空白溶液不干扰含量测定，方法专属性较好；对照品溶液重复进样6次，四种防腐剂色谱峰保留时间和峰面积的RSD%在0.07%-0.12%和0.05%-0.35%之间，仪器精密度良好；以外标法定量，在0.5-50 ug/mL 浓度范围内，线性相关系数均>0.9999，准确度在98.3-107.7%之间；加标回收和精密度实验测试表明，方法准确度高，重复性好，，可为疫苗及生物制品中四种防腐剂残留测定提供参考。 防腐剂在疫苗生产过程中主要用于抑制微生物生长的一类重要物质。目前除了硫柳汞外，在生物制品及医药防腐剂中还常见如苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇、羟苯甲酯。在《中国药典》三部(2020版)关于苯酚按照通则3113进行检测，使用滴定显色法进行测定，含量应不高于3.0g/L；间甲酚按照通则3114使用比色法进行测定，含量不高于 2.5 g/L； 2-苯氧乙醇按照附录2液相色谱法进行检测，应为4.0-6.0 mg/mL. 目前不同防腐剂使用不同的检测方法，对于检测机构方法种类多且工作量大，而滴定法灵敏度及误差 较大，需要工作人员有一定的视觉灵敏度和长期操作经验。目前亟开发能同时快速用于生物制品中多种防腐剂的快速检测方法。 液相色谱仪作为一种常见便捷的色谱分析系统，在含量分析监测中广泛使用，本文建立了一种采用液相色谱仪对生物制品中苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇、羟苯甲酯残留量同时检测的分析方法。样品经乙腈沉淀蛋白后直接进样分析，前处理简单、分析速度快、灵敏度高，可供相关检测人员参考。 1.1仪器 本实验采用岛津超高效液相色谱仪LC-40， 具体配置为： 系统控制器： CBM-40lite脱气机： DGU-20A，输液泵：LC-40BXR×2自动进样器：SIL-40C XR木温箱：CTO-40C检测器：SPD-40V 色谱工作站： LabSolutionsVer.5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shimadzu Shim-pack GIST 100 mm x 2.1 mm l.D.， 2.0 um；； P/N：227-30001-04；岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A-水；B-乙腈 流速：0.4mL/min柱温：40℃进样体积：5uL检测波长：220nm、270nm 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 7.00 Pumps Pump B Conc. 40 7.50 Pumps PumpB Conc. 95 9.00 Pumps Pump B Conc. 95 9.20 Pumps Pump B Conc. 10 13.00 Controller Stop 1.3标准溶液制备 以75%乙腈水溶液配制苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇、羟苯甲酯混合标准贮备液(1000 ug/mL)，同时逐级稀释为0.5、1、2、5、10、20、50 ug/mL共6个标准系列工作溶液，待测。 1.4样品前处理 准确取100 pL样品溶液，加入300uL乙儿，涡旋混匀，14000 rpm 离心5 min， 上机分析。 结果与讨论 2.1系统适应性和分离度 按照1.2中分析条件测试对照品溶液，色谱图如图1所示。通过梯度洗脱方式，四种化合物分离度良好，且分离度均大于3(详见图2)，满足液相色谱中关于定量色谱分离度要求。 uV 图11ug/mL四种化合物对照品溶液色谱图 ID 化合物名 保留时间 面积 分离度(USP) 1 苯酚 4.783 52468 2 2-苯氧乙醇 5.460 44642 3.072 3 羟苯甲酯 6.223 27520 3.651 4 间甲酚 6.833 46521 3.070 图2 四种化合物分离度表长((220 nm 十算) 2.2专属性 取空白溶剂进行测定，色谱图如下图3所示。在270nm(羟苯甲酯定量通道)和220nm(苯酚、2苯氧乙醇、间甲酚定量通道)波长下，对照品i(0.5ppm)中四种物质出峰位置处同空白溶剂色谱图相比均无干扰，，专属性良好。 图3 对照品(0.5ppm)和空白溶剂270 nm 和220nm 色谱图 2.3线性关系 按照1.3配制6个不同浓度的标准系列溶液，按照1.2中的分析条件进行测定。羟苯甲酯以270 nm 作为定量通道，苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇以220 nm 作为定量通道，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，外标法绘制标准曲线。各化合物标准曲线见图4，线性方程、相关系数和定量限见表2。 图4 标准曲线 表2 线性关系和定量限 # 名称 校准曲线 线性范围 (ug/mL) 准确度 (%) 相关系数 定量限 (ug/mL) 定量限 S/N 1 苯酚 Y=52，502.2X-738.156 0.5-50 98.4-101.8 0.9999 0.5 29.87 2 2-苯氧乙醇 Y=44，973.2X-2，014.03 0.5~50 98.8~107.7 0.9999 0.5 27.03 3 羟苯甲酯 Y=50，387.7X-137.568 0.5-50 98.3-105.0 0.9999 0.5 23.84 4 间甲酚 Y=46，596.7X-1，138.14 0.5-50 98.5-103.9 0.9999 0.5 30.78 2.4精密度实验 按照1.2分析条件，分别取 0.5 ug/mL、20ug/mL对照品溶液上机测试，并计算各化合物保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD)，，以评价系统的检测结果的重复性。表3结果显示，目标物保留时间和峰面积的RSD 分别在 0.07%-0.12%和0.05%-0.35% 之间。精密度实验结果表明，仪器精密度良好。 表3精密度结果(n=6) 名称 RSD%(0.5 ug/mL) RSD%(20ug/mL) R.T. Area R.T. Area 苯酚 0.11 0.19 0.12 0.09 2-苯氧乙醇 0.11 0.12 0.12 0.07 羟苯甲酯 0.07 0.35 0.10 0.05 间甲酚 0.08 0.15 0.10 0.05 2.5样品检测和加标回收实验 使用本方法检测了A群C群脑膜炎球菌多糖结合物原液样品，在阴性样品中添加标准溶液，配制为两个不同浓度的加标样品，每个浓度平行制备三份，按照1.4处理后上机分沐，样品检测结果和加标回收结果见表4。加标回收率在 96.80~101.30%之间，测试结果的 RSD 在 0.05~0.28%之间，方法可靠。 表 4样品加标回收率(n=3) 化合物名称 样品含量 2 ug/mL 20 pg/mL ng/mL 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 苯酚 N.D. 96.80 0.21 100.60 0.05 2-苯氧乙醇* N.D. 99.20 0.09 101.00 0.07 羟苯甲酯 N.D. 98.00 0.28 101.10 0.19 间甲酚 N.D. 98.10 0.17 101.30 0.10 注：N.D.表示未检出。 结论 本文建立了一种使用岛津LC-40液相色谱测定疫苗中苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇、羟苯甲酯防腐剂残留的方法。实验结果表明系统适用性试验、专属性、线性、精密度及回收率试验结果均满足足测要求，并使用该方法对A群C群脑膜炎球菌多糖结合物原液样品进行检测。本方法快速、灵敏、准确，适用于疫苗及生物制品中四种常见的苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇、羟苯甲酯防腐剂的检测和监控。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津LC-40液相色谱测定疫苗中苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇、羟苯甲酯防腐剂残留的方法。实验结果表明系统适用性试验、专属性、线性、精密度及回收率试验结果均满足检测要求，并使用该方法对C群脑膜炎球菌多糖结合物原液样品进行检测。本方法快速、灵敏、准确，适用于疫苗及生物制品中四种常见的苯酚、间甲酚、2-苯氧乙醇、羟苯甲酯防腐剂的检测和监控。