饲料中硝基咪唑类药物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-467Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-537 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045 测定饲料中4种硝基咪唑类药物含量 LCMSMS-537 摘要：本文参考《农业农村部公告第197号-1-2019饲料中硝基咪唑类药物的测定液相色谱-串联质谱法》，使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了饲料中甲硝唑、二甲硝唑、洛硝达唑和替硝唑的分析方法。样品中的硝基咪唑类药物经磷酸缓冲液提取，以HLB固相萃取柱净化后，吹干复溶过滤后进样分析。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据；空白样品处理后，加入不同浓度的标样，制作校准曲线，外标法定量。结果表明：方法定量限低于5 ug/kg， 满足标准要求；在10-5000 ng/mL的线性范围内，各目标组分标点浓度准确度均在88.9-111.6%之间， R不低于0.9967；残留考察结果表明 5000 ng/mL 样品进样后无明显系统残留；空白样品添加不同浓度各目标组分后进行处理，检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求。该方法灵敏度和准确度高，适合饲料中4种硝基咪唑化合物检测。 关键词： LCMS-8045饲料 硝基咪唑 食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单。 硝基咪唑类有机化合物是一类具有硝基咪唑环结构的药物，包括甲硝唑(MNZ)、.二甲硝咪唑(DMZ)、异丙硝肖(IPZ)、塞可硝唑(SCZ)、奥硝唑(ONZ)、替硝唑(TNZ)和洛硝哒唑 (RNZ)等。 硝基咪哇类药物具有致突变性和潜在的致癌性，被许多国家列为违禁药物。2019年12月27日， 《中华人民共和国农业农村部第250号文》将硝基咪唑列入 本文参照《农业农村部公告第197号-1-2019饲料中硝基咪唑类药物的测定液相色谱-串联质谱法》，使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了饲料中4种硝基咪唑的分析方法。该方法灵敏度和准确度高，适合饲料中该类化合物的检测。 1.1仪器 本实验采用岛津 Nexera LC-40B X3 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统。具体配置为： 系统控制器：CBM-40自动进样器：SIL-40CX3输液泵：LC-40BX3质谱仪： LCMS-8045柱温箱： CTO-40S色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 SP2 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack Velox SP-C18， 50 mm×2.1 mm l.D.，1.8um(岛津(上海)实验器材有限公司，P/N： 227-32001-02) 流动相：A-0.1%甲酸水溶液；B-0.1%甲酸乙腈溶液 流速：0.30 mL/min 柱温：25℃ 进样量：2uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5% 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 4.00 Pumps Pump B Conc. 5 6.00 Pumps Pump B Conc. 90 6.10 Pumps Pump B Conc. 5 8.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8045 加热模块温度：300℃ 离子子： ESI DL 温度：250℃ 雾化气流速：3.0 L/min 离子源温度：400℃ 加热气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速：10.0 L/min MRM参数：见表2 表2 MRM 参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE Q3 Pre Bias (V) 172.20 128.10* -12.0 -17.0 -13.0 甲硝唑(MNZ) 82..10 -12.0 -25.0 -30.0 2 142.20 96.10* -13.0 -16.0 -17.0 二甲硝唑(DMZ) 81.10 -29.0 -28.0 -29.0 3 洛硝达唑(RNZ) 201.20 140.20' -10.0 -12.0 -28.0 55.05 -10.0 -30.0 -10.0 4 替硝唑 (TNZ) 248.20 121.10 -12.0 -17.0 -25.0 82.10 -12.0 -35.0 -15.0 *定量离子对 1.3样品前处理 (1)试样提取：参照《农业农村部公告第197号-1-2019饲料中硝基咪唑类药物的测定液相色谱-串联质谱法》中“7.1提取”部分，称取2g样品于50mL离心管中(平行2份)，准确加入1 mol/L 磷酸盐缓冲液，涡旋 1 min， 300 r/min 振荡 30 min， 8000 r/min 离心10 min， 取上清液至另一离心管种。下层残渣加入1 mol/L磷酸盐盐冲液5mL 重复提取一次， 8000 r/min 离心10 min。合并2次提取液，备用 (2)试样净化：参照《农业农村部公告第197号-1-2019饲料中硝基咪唑类药物的测定液相色谱-串联质谱法》中“7.2净化”部分，将HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL)依次用5mL乙腈、35mL的1mol/L磷酸盐缓冲液活化，将提取液全部加载于 HLB柱上，用5mL的5%乙腈溶液淋洗，抽干，用5mL乙腈洗脱，收集洗脱液，30℃氮吹至干，用1mL的20%乙乙溶液溶解，过0.22 um 尼龙材质滤膜后上机测定。 结果讨论 2.1专属性和灵敏度 空白样品和5 ug/kg(方法定量限)加标样品处理后进样的 MRM 色谱图如图1所示，空白样品无干扰。个目标组分该浓度色谱峰 S/N 均大于10，满足灵敏度要求。 图1 空白样品(蓝)和5 ug/kg加示样品(绿)MRM 色谱图 2.2校准曲线 空白样品加标后处理，制得理论浓度分别为10、50、100、500、1000、5000 ng/mL的基质加标溶液，外标法建立校准曲线如图3所示，线性方程、相关系数及准确度如表3所示。 图2 校准曲线 表3 较准曲线参数 目标物 线性范围(ng/mL) 线性方程 相关系数r 准确度 (%) MNZ 10-5000 Y=(4381.97)X-(5507.41) 0.9977 92.0-110.4% DMZ 10-5000 Y=(5078.02)X-(4123.94) 0.9967 89.8-111.1% RNZ 10-5000 Y=(4542.49)X-(960.46) 0.9978 91.7-109.2% TNZ 10-5000 Y=(3228.67)X-(6200.78) 0.9968 88.9-111.6% 2.3残留考察 5000 ng/mL 样品进样后，空白样品进样与加标浓度 LLOQ 样品色谱图如图3所示，4种目标组分保留时间处无明显色谱峰。 Q172.20>128.10(+) 2.76e2 图3 残留考察(蓝-空白样品，绿-LLOQ) 2.4重复性考察 对不同浓度的加标样品分别连续分析6次，计算保留时间和峰面积的RSD. 结果见表4，保留时间 RSD 均不高于0.19%，峰面积 RSD 均不高于6.19%. 表4 保留时间和面积 RSD 名称 浓度(ng/mL) 保留时间 RSD(%) 峰面积 RSD (%) 10 0.16 2.17 MNZ 100 0.13 1.68 1000 0.13 0.80 10 0.10 4.21 DMZ 100 0.10 1.76 1000 0.17 1.12 10 0.19 4.58 RNZ 100 0.12 2.06 1000 0.19 0.86 10 0.14 6.19 TNZ 100 0.06 3.60 1000 0.11 2.15 2.5平行样考察 空白样品中添加不同浓度的目标组分后进行前处理，各平行制备两份，上机测定。 参照标准规定，以保留时间(与标曲样品保留时间平均值相对偏差不高于2.5%)和离子对相对丰度比(范围由标曲样品离子丰度比平均值确定)为定性依据，定性结果如表5所示。保留时间以及离子丰度比相对偏差均未超出规定范围，符合要求。 表5 定性结果 样品 保留时间 保留时间相对 离子丰度比 离子丰度比相 化合物 (min) 偏差(%) 对偏差(%) 标曲样品 1.631 一- 90.10 - SA1-平行1 1.635 0.25 88.60 1.66 MNZ SA1-平行2 1.634 0.18 85.44 5.17 SA2-平行1 1.634 0.18 87.66 2.71 SA2-平行2 1.634 0.18 89.73 0.41 标曲样品 2.265 - 71.34 - SA1-平行1 2.277 0.53 73.19 2.59 DMZ SA1-平行2 2.275 0.44 76.32 6.98 SA2-平行1 2.278 0.57 76.90 7.79 SA2-平行2 2.275 0.44 76.42 7.12 标曲样品 2.211 - 26.11 - RNZ SA1-平行1 2.212 0.05 25.38 2.80 SA1-平行2 2.210 0.05 27.84 6.63 SA2-平行1 2.214 0.14 26.73 2.37 SA2-平行2 2.215 0.18 27.07 3.68 标曲样品 5.188 - 30.78 - SA1-平行1 5.188 0 25.69 16.54 TNZ SA1-平行2 5.189 0.02 27.32 11.24 SA2-平行1 5.187 0.02 32.41 5.30 SA2-平行2 5.190 0.04 33.50 8.84 参照标准规定，各待测样品均记录2份平行处理样品中目标物的含量，按公式 RD=(|C1-C2|/C平均)*100%计算相对相差，结果应不超过20%，结果如表5所示，实际样品的双平行处理样相对相差均不高于20%，符合要求。 表6定量结果及相对相差 化合物 样品 含量(ng/g) 双样相对 平行1 平行2 平均值 相差(%) MNZ SA1 7.86 7.62 7.74 1.81 SA2 127.86 136.07 131.97 3.11 DMZ SA1 6.75 6.55 6.65 1.50 SA2 122.92 126.88 124.90 1.59 RNZ SA1 8.22 7.67 7.95 3.52 SA2 123.55 129.03 126.29 2.17 TNZ SA1 7.76 7.33 7.55 2.91 SA2 125.33 132.28 128.81 2.69 结论 本文参考《农业农村部公告第197号-1-2019饲料中硝基咪唑类药物的测定液相色谱-串联质谱法》，使用岛津LCMS-8045 三重四液杆液质联用仪，建立了饲料中甲硝唑、二甲硝唑、洛硝达唑和替硝唑的分析方法。样品中的硝基咪唑类药物经磷酸缓冲液提取，以HLB固相萃取柱净化后，吹干复溶过滤后进样分析。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据；空白样品处理后，加入不同浓度的标样，制作校准曲线，外标法定量。结果表明：方法定量限低于5 ug/kg，满足标准要求；在10-5000 ng/mL 的线性范围内，各目标组分标点浓度准确度均在 88.9-111.6%之间，R不低于0.9967；残留考察结果表明5000 ng/mL样品进样后无明显系统残留；空白样品添加不同浓度各目标组分后进行处理，检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求。该方法灵敏度和准确度高，适合饲料中4种硝基咪唑化合物检测。 岛津应用云 样品中的硝基咪唑类药物经磷酸缓冲液提取，以HLB固相萃取柱净化后，吹干复溶过滤后进样分析。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据；空白样品处理后，加入不同浓度的标样，制作校准曲线，外标法定量。结果表明：方法定量限低于5   μg/kg，满足标准要求；在10-5000   ng/mL的线性范围内，各目标组分标点浓度准确度均在88.9-111.6%之间，R不低于0.9967；残留考察结果表明5000   ng/mL样品进样后无明显系统残留；空白样品添加不同浓度各目标组分后进行处理，检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求。该方法灵敏度和准确度高，适合饲料中4种硝基咪唑化合物检测。