饲料中福莫特罗和阿福特罗检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-468Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-538 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045 测定饲料中福莫特罗和阿福特罗含量 LCMSMS-538 摘要：本文参考《农业农村部公告第197号-7-2019饲料福福莫特罗、阿福特罗的测定液相色谱-串联质谱法》，使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了饲料中福莫特罗、阿福特罗的分析方法。饲料中的福莫特罗、阿福特罗经盐酸甲醇提取液提取，混合型阳离子交换柱净化后，洗脱液氮气吹干，复溶后经0.22um 滤膜过滤后待测。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据；配制不同浓度的标准样品溶液，制作校准曲线，内标法定量。结果表明：方法定量限低于 0.05mg/kg， 满足标准要求；在2-100ng/mL的线性范围内，各标点浓度准确度分别在 92.3-110.2%之间，R为0.9984；残留考察结果表明100 ng/mL标准样品进样后无明显系统残留；空白样品添加不同浓度福莫特罗/阿福特罗后进行处理，检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求。该方法灵敏度和准确度高，适合饲料中福莫特罗和阿福特罗检测。 关键词： LCMS-8045饲料斗福莫特罗阿福特罗 福莫特罗(阿福特罗为外消旋福莫特罗(R，R-福莫特罗)的单异构体)为常见的β-受体激动剂类药物之一，亦即常见的“瘦肉精”类药物之一。“瘦肉精”类药物在上世纪90年代广泛应用于鸭、猪、肉牛等动物的饲料中，可以减少动物脂肪生成，促进蛋白质合成，增加瘦肉率。但是此类药物会在动物组织中残留，通过食物链进入人体内后，有可能导致食用者心慌、战栗、头疼、呕吐等症状， 66“瘦肉精”中毒事件也时有报道。 2001~2002年，农业部等国家部委先后下发了第176号公告、第193号公告和第1519号条例等禁禁使用β-受体激动剂类药物作为兽药和饲料添加剂。 本文参照《农业农村部公告第197号-7-2019饲料中福莫特罗、阿福特罗的测定液相色谱-串联质谱法》，使用岛津LCMS-8045三重四杆杆液质联用仪，建立了饲料中福莫特罗和阿福特罗的分析方法。该方法灵敏度和准确度高，适合饲料中福莫特罗和阿福特罗的检测。 系统控制器：CBM-40自动进样器：SIL-40CX3输液泵：LC-40B X3质谱仪： LCMS-8045柱温箱： CTO-40S色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 SP2 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱：Shim-pack GIST C18， 100 mm×2.1 mml.D.，2um(岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-30001-04) 流动相： A-0.2%甲酸水溶液；B-甲醇 流速：0.30mL/min 柱温：30℃ 进样量：4uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20% 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 3.00 Pumps Pump B Conc. 80 5.50 Pumps Pump B Conc. 80 5.60 Pumps Pump B Conc. 20 10.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8045 加热模块温度：300℃ 离子子： ESI DL 温度：250℃ 雾化气流速：3.0L/min 离子源温度：400℃ 加热气流速： 10.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速： 10.0 L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE Q3 Pre Bias (V) 1 2 福莫特罗/ 345.20 351.30 149.15* -13.0 -19.0 -28.0 阿福特罗 327.20 -13.0 -13.0 -23.0 福莫特罗-D6 155.20 -13.0 -21.0 -30.0 *定量离子对 1.3样品前处理 (1)试样提取：参照《农业农村部公告第197号-7-2019饲料中福莫特罗、阿福特罗的测定液相色谱-串联质谱法》中“7.1提取”部分，称取2g样品于50mL离心管中，加入内标工作液100 uL、19 mL盐酸甲醇提取液和1mL饱和醋酸铅溶液，摇匀，充分振荡20 min， 于7000 r/min 离心10 min， 取上清液备用。 (2)试样净化：参照《农业农村部公告第197号-7-2019饲料中福莫特罗、阿福特罗的测定液相色谱-串串质谱法》中“7.2净化”部分，将 MCX 固相萃取小柱(60 mg/3mL)依次用3mL甲醇、3mL水活化，准确移取5mL备用液过柱，依次用2mL水、2mL甲醇淋洗，真空抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液，50℃氮吹至干，用1mL的0.2%甲酸水溶液溶解，过0.22 um 滤膜后上机测定。若进样溶液浓度超出校准曲线线性范围，进样前以0.2%甲酸水溶液稀释后检测。 结果讨论 2.1 专属性与灵敏度 空白样品和0.05 mg/kg(方法定量限)加标样品处理后进样的 MRM 色谱图如图1所示，空白样品无干扰。目标组分该浓度色谱峰 S/N 远大于10，满足灵敏度要求。 图1 空白样品和0.05 mg/kg 加标样品MRM 色谱图 2.2校准曲线 以0.2%甲酸水水液为溶剂，配制浓度分别为2、5、10、20、50、100 ng/mL 的标准样品(内标浓度 25 ng/mL)，内标法建立校准曲线如图2所示。 图2校准曲线 2.3残留考察 100 ng/mL标准样品进样后，空白样品和2ng/mL样品(校准曲线最低浓度点)进样得色谱图如图3所示，福莫特罗/阿福特罗保留时间处无明显色谱峰。 图3 残留考察 2.4重复性考察 对不同浓度的标准样品分别连续分析6次，计算保留时间和峰面积的 RSD. 结果见表3，保留时间 RSD 均不高于0.17%，峰面积 RSD 均不高于1.82%。 表3保留时间和面积 RSD 名称 浓度(ng/mL) 保留时间 RSD(%) 峰面积RSD (%) 福莫特罗/阿福特 罗标准溶液 2 0.13 1.82 10 0.17 1.41 100 0.09 1.07 2.5平行样考察 空白样品中添加不同浓度的福莫特罗后进行前处理，各平行制备两份，上机测定。 参照标准规定，以保留时间(与标曲样品保留时间平均值相对偏差不高于2.5%)和离子对相对丰度比(范围由标曲样品离子丰度比平均值确定，本文中离子丰度比为20~50%，要求最大允许相对偏差范围为25%)为定性依据，定性结果如表4所示。保留时间以及离子丰度比相对偏差均未超出规定范围，符合要求。 表4 定性结果 No. 样品 保留时间 保留时间相对 离子丰度比 离子丰度比相对 (min) 偏差((%) 偏差(%) 1 标曲样品 2.332 一 45.00 - SA1-平行1 2.317 0.64 44.21 1.76 SA1-平行2 2.318 0.60 50.10 11.33 4 SA2-平行1 2.316 0.69 46.98 4.40 5 SA2-平行2 2.320 0.51 47.67 5.93 参照标准规定，各待测样品均记录2份平行处理样品中目标物的含量，按公式 RD=(|C1-C2|/C平均)*100%计算相对相差，结果应不超过20%，结果如表5所示，实际样品的双平行处理样相对相差均不高于20%， 符合要求。 表5 定量结果及相对相差 NO. 样品 含量(ng/g) 双样相对 平行1 平行2 平均值 相差(%) SA1 14.66 19.19 16.93 13.38 2 SA2 176.84 165.59 171.22 3.29 结论 本文参考《农业农村部公告第197号-7-2019饲料中福莫特罗、阿福特罗的测定液相色谱-串联质谱法》，使用岛津 LCMS-8045 三重四极杆液质联用仪，建立了饲料中福莫特罗和阿福特罗的分析方法。尿液中的福莫特罗、阿福特罗经盐酸甲醇提取液提取，混合型阳离子交换交净化后，洗脱液氮气吹干，复溶后经0.22 um滤膜过滤后待测。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据；配制不同浓度的标准样品溶液，制作校准曲线，内标法定量。结果表明：方法定量限低于 0.05 mg/kg， 满足标准要求；在2-100 ng/mL 的线性范围内，各标点浓度准确度分别在92.3-110.2%之间，R为0.9984；残留考察结果表明 100 ng/mL 标准样品进样后无明显系统残留；空白样品添加不同浓度福莫特罗/阿福特罗后进行处理，检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求。该方法灵敏度和准确度高，适合饲料中福莫特罗和阿福特罗检测。 岛津应用云 饲料中的福莫特罗、阿福特罗经盐酸甲醇提取液提取，混合型阳离子交换柱净化后，洗脱液氮气吹干，复溶后经0.22   μm滤膜过滤后待测。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据；配制不同浓度的标准样品溶液，制作校准曲线，内标法定量。结果表明：方法定量限低于0.05mg/kg，满足标准要求；在2-100   ng/mL的线性范围内，各标点浓度准确度分别在92.3-110.2%之间，R为0.9984；残留考察结果表明100   ng/mL标准样品进样后无明显系统残留；空白样品添加不同浓度福莫特罗/阿福特罗后进行处理，检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求。该方法灵敏度和准确度高，适合饲料中福莫特罗和阿福特罗检测。