肉制品中刚果红检测方案(液质联用仪)

分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)第31卷第6期2012年6月Vol.31 No.6730~733102 103第6期凌 睿等：高分辨快速液相色谱-串联质谱法测定肉制品中的刚果红731 N S实验技术 高分辨快速液相色谱-串联质谱法测定肉制品中的刚果红 凌 睿*，胡文彦，乔玲 (南京市产品质量监督检验院 国家农副产品质量监督检验中心，江苏 南京 210028) 摘 要：建立了肉制品中刚果红的高分辨快速液相色谱-串联质谱(RRLC-MS/MS)测定方法。均质后的样品经乙腈与正己烷混合溶剂(1：1)提取，乙腈提取层离心后直接上机测试。使用 Agilent XDB Cig色谱柱，以乙腈和10 mmol/L 甲酸铵水溶液为流动相梯度洗脱，采用多反应监测方式(MRM)负离子模式检测，定量离子对与定性离子对分别为 m/z 325.0/416.0 与 m/z651.0/152.0，外标法定量。结果表明，刚果红在0.1~10mg/L范围内线性关系良好(?>0.999)，加标回收率为91%~102%， RSD 为1.2%~4.0%，检出限与定量下限分别为 0.07 mg/kg 和0.18 mg/kg。该方法准确、高效，可用于肉制品中刚果红染料的快速检测。 关键词：刚果红；高分辨快速液相色谱-串联四极杆质谱；肉制品 中图分类号：0657.63；TE624.8 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2012)06-0730-04 doi： 10.3969/j. issn. 1004-4957.2012.06.019 Determination of Congo Red in Meat Products by Rapid Resolution LiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry LING Rui， HU Wen-yan， QIAO Ling (Nanjing Bureau of Quality and Technical Supervision， National Supervision Testing Center forAgricultural and Sideline Products(Nanjing)， Nanjing210028， China) Abstract： A rapid resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometric(RRLC -MS/MS)method was firstly developed for the determination of Congo red in meat products. Homogenized sam-ples were extracted with acetonitrile -n-hexane mixture(1：1) and the acetonitrile extraction weretransferred for immediate testing after centrifugated by 15 000 r/min for 10 min. The target compoundwas separated on an Agilent XDB Cig column with acetonitrile -10 mmol/L ammonium formate as mo-bile phase by gradient elution， and determined by tandem mass spectrometry with multiple reactionmonitoring(MRM) mode under negative electrospray ionization mode. The two precursor-product ionpairs， m/z 325.0/416.0 and m/z 651.0/152.0， were used as the quantizative and qualificative i-ons， respectively. The external standard method was used for quantitative analysis. The resultsshowed a good linearity in range of 0. 1 -10 mg/L with correlation coefficients higher than 0.999.The average recoveries of three spiked levels including high， medium and low concentrations were be-tween 91% and 102%， with relative standard deviations(RSDs) of 1.2%-4.0%. The limits ofdetection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) were 0.07 mg/kg and 0. 18 mg/kg， respective-ly. The proposed method was accurate and high efficient， and could meet the requirements for therapid detection of Congo red in meat products. Key words： Congo red； RRLC-MS/MS； meat products 刚果红(Congo red， CAS 573-58-0)又名直接大红 28(Direct red 28)，属于联苯胺为母体的红色偶氮染料，一般用于临床诊断、指示剂、生物染色剂及化学指示剂等。刚果红对各种动物机体为可 ( 收稿日期：2012-02-15；修回日期：2012-03-13 ) ( 基金项目：国 家 科技支撑计划(2011BAK21B05)；江苏省质监局科技项目(KJ112519) ) ( *通讯作者：凌 睿 ，硕 士 ，高级工 程 师，研究方向：食品安全检测技术， T el： 025-85416935， E-mail： lingr@ njzj. gov. cn ) 疑致癌物与诱变剂[21，并会对胎儿性腺发育产生不良影响[3]，在特定条件下，刚果红可降解释放出联苯胺类物质。由于对人体健康的危害很大，刚果红被很多国家列为禁用偶氮染料。 近年来食品安全事件频发，其中添加非食用甚至有毒物质的情况尤为突出，由于价格低、着色强、稳定性强等特点，非食用工业染料常被违法应用到食品加工中4]。为使肉制品色泽鲜艳，不法食品加工商随意使用有毒的工业染料代替食用色素，对消费者的身体健康造成极大危害。刚果红不是食品添加剂，而是一种有毒的非食用物质，在食品中添加会严重威胁人民群众的饮食安全，因此有必要建立一种灵敏、准确、快速的检测肉制品中刚果红的方法。 国内外有关食品中刚果红染料的测定未见报道。侍芳[5]采用液相色谱单级质谱(LC-MS)测定了环境水样中刚果红的含量，该方法由于样品基质及仪器设备的限制，不适用于食品中刚果红的准确测定。由于食品基质比较复杂，加之食品中非法添加的工业染料多为水溶性盐类，前处理多采用固相萃取(SPE)、液液萃取(LLE)以及基质固相分散(MSPD)等技术[6-13]去除样品中的大量杂质，而后采用液相色谱及液相色谱质谱联用法进行测定19-12]。高分辨快速液相色谱-串联质谱法(RRLC -MS/MS)具有高灵敏度、高分离度的特点14-15]，本文采用混合溶剂直接提取的前处理手段，建立了肉制品中刚果红的高分辨快速液相色谱-串联质谱检测方法。 实验部分 1.1 仪器、试剂与材料 1200 RRLC-6410 QQQ MS/MS 串联四极杆质谱仪，配备电喷雾(ESI)离子源及 MasshunterB03.01质谱工作站(美国 Agilent 公司)； Sigma3-18K 高速冷冻离心机(德国 Sigma 公司)，万分之一电子天平(瑞士Mettler - Toledo 公司)。 刚果红标准物质(美国 AccuStandard 100 mg/L， 溶剂为甲醇)；乙腈、正己烷(色谱纯， ROE 公司)；实验用水为经Milli-Q净化系统(0.22 u.m过滤膜)过滤的超纯水，甲酸铵(分析纯)。 熟牛肉、猪肉及其制品购于本地农贸市场、超市等地。 1.2样品前处理 准确称取5g均质化后的样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 正己烷及10 mL乙腈，拧紧盖子，上下剧烈振摇100次后，于离心机中以5000 r/min 离心 10 min， 取下层乙腈溶液1mL于离心机中以15 000 r/min 离心10 min， 取上清液上机测试。乙腈层颜色较深的样品可适当稀释，使其浓度在线性范围之内。 1.3 分析条件 1.3.1色谱条件 色谱柱为 Agilent XDB Cjg柱(2.1 mm×50 mm， 1.8 pm)；柱温35℃，进样量1pL；流动相A 为 10 mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流速0.3 mL/min， RRLC 系统管路调节为低延迟体积模式。流动相梯度洗脱程序为： B在5 min 内由20%线性升至80%，再于1 min 后降至20%，保持2 min， 单次分析时间为8 min。 1.3.2质谱条件 电离模式： ESI(-)；毛细管电压4000V；干燥气温度：320℃；干燥气流速9.0L/min； 雾化气压力40 psi；其余参数通过仪器自动调谐至最优化。选择多反应监测模式(MRM)，定性离子对与定量离子对分别为 m/z 651.0/152.0和m/z 325.0/416.0。碎裂电压分别为70V和130V， 碰撞气分别为39V和13V，驻留时间均为100 ms。 2 结果与讨论 2.1 测试条件的优化 2.1.1色谱条件的优化 在纯甲醇-水或乙腈-水流动相体系中，刚果红的响应非常低，不能满足分析要求。在负离子模式下，有机相选择甲醇、乙腈，水相选择甲酸铵、乙酸铵、氨水的水溶液等常见体系时，发现刚果红在乙腈-甲酸铵体系下的响应值最大。随随考察了甲酸铵添加浓度分别为5、10、20、30 mmol/L时的响应值，发现甲酸铵浓度为 10 mmol/L时待测离子的响应值最高，因此最终选择乙腈-10 mmol/L 甲酸铵溶液作为流动相。在此条件下，刚果红的保留时间为2.7 min，加标样品谱 图见图1A。 刚果红在反相色谱柱上的保留较弱， 且本实验前处理过程较为简单，需要较好的色谱分离条件作为补充。本实验采用梯度洗脱的方式不仅能使目标物与干扰组分完全分离并降低基质的影响，同时避免了连续进样过程中强保留物质的堆积效应。 2.1.2 月质谱参数的选择与优化 在实验前采用系统的Autotune 功能对质谱系统各参数进行快速优化。刚果红的分子量为696.69，选择扫描范围 m/z 100~1 000， 断开色谱柱，将标准溶液直接进质谱分析，同时采集正负离子信号，发现目标物在负离子模式下的响应值远大于正离子模式，这与刚果红带两个磺酸结构有关。刚果红的一级质谱在 ESI负离子化模式下产生m/z 651.0[M-2Na+H]"及m/z 325.0 图1 加标样品的多反应监测(MRM)色谱图(A)、裂解途径(B)与监测离子子(C) Fig.1 Multiple reaction monitoring spectrum(MRM) ofspiked sample(A) and fragmentation mechanism(B)and monitored ions(C) of Congo red [M-2Na]²-两个离子信号，符合文献报道的联苯胺偶氮染料的电喷雾质谱特征16-17。选择 m/z 651.0进行子离子扫描，生成的主要碎片离子为 m/z 152.0，其为母离子失掉两侧偶氮苯磺酸结构后剩余的联苯基团(图1B)，改变碰撞电压无其他明显离子出现。再选择 m/z 325.0进行子离子扫描，生成的主要碎片离子为 m/z 416.0，其为母离子一侧的偶氮N=N 键断裂后剩余的碎片基团(图1B)，因刚果红为对称结构，其丰度较前者高，适合作为定量离子，同时改变碰撞电压无其他明显离子出现。将丰度较大的一对离子对 m/z 325.0/416.0 作为定量离子对， m/z 651.0/152.0 作为定性离子对(图1C)。最后对其裂解电压参数及碰撞电压进行优化，最终选择“1.3.2”条件进行检测。 2.2 前处理条件的优化 刚果红易溶于水及极性较强的有机溶剂(如甲醇、乙腈)，而在乙醚、正己烷等非极性溶剂中的溶解度极小[18]。本实验采用正己烷与乙腈(1：1)混合溶液对肉制品中的目标物进行提取，以正己烷除去样品中的脂肪及其他大量非极性物质，尽可能减少其在反相C柱上的残留。以脂肪含量高达35%的香肠样品为例，5 g样品经10 mL正己烷提取一次后，脂肪含量可降至5%以下，因此实验采用10 mL正己烷；此外，肉制品中还含有大量的氯化钠及谷氨酸钠等物质，这些不挥发盐类在有机溶剂中的溶解度较小，而使用乙腈提取刚果红不仅可极大地降低不挥发盐类对质谱仪器的影响，同时具有沉淀蛋白的作用，可有效提取目标物，降低基质效应。 比较了超声、涡旋及手摇等提取方式的效果，发现在相同的提取时间内超声及涡旋方式的提取效率较手工振摇差，但在振摇过程中应注意选择密封性良好的离心管，否则易造成损失。在振摇次数上依次选择50、100、200、300次进行试验，发现振摇100次以上回收率趋于平稳，因此选择手工振摇100 次。 由于刚果红会被微孔滤膜吸附，且不同材质的滤膜对其吸附作用不同，因此不能采用过滤的方式去除颗粒杂质，否则会造成待测物的损失。本实验采用高速离心沉淀的方法去除不溶物，效果良好。 2.3 方法学验证 2.3.1 标准曲线与线性范围 将刚果红红准溶液用空白基质溶液稀释成0.1、0.5、2.0、5.0、10.0mg/L的标准工作液，将标准工作液上机测试，外标法定量，以响应值(y)为纵坐标，质量浓度(x，mg/L)为横坐标进行线性拟合。结果显示，刚果红的响应值与质量浓度在0.1~10.0 mg/L范围内线性关系良好，回归方程为y=162.04x+20.284，?=0.9994。 2.3.2回收率与灵敏度变在不含刚果红的肉制品中加入高、中、低3个水平的标准工作溶液进行加标回收率与精密度测试，结果见表1。3个加标水平下刚果红的回收率为91%~102%，相对标准偏差为1.2%~4.0%，表明本方法回收率高、平行性好，可用于肉制品中刚果红的准确测定。 表1肉制品中刚果红的加标回收率与相对标准偏差(n=6) Table 1 ]Recoveries and RSDs of Congo red in meat products(n=6) Sample Added w/(mg·kg) Recovery R/% RSD s，/% Cooked beef(熟牛肉) 0.5，2.0，10.0 102，100， 102 3.8，1.9，1.2 Sausage(香肠) 0.5，2.0，10.0 100， 99， 99 2.6，2.1，1.9 Pork jerky(猪肉脯) 0.5，2.0，10.0 91，94， 93 4.0， 3.2，2.4 根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义，分别以3倍与10倍背景噪音的标准偏差分析信号的待测物浓度作为本方法的检出限与定量下限，得到肉制品中刚果红的检出限与定量下限分别为0.07 mg/kg 和0.18 mg/kg。 2.3.3实际样品的检测从本地超市、农贸市场及街边流动摊贩购得各类肉制品43批，其中散装熟牛肉14批，散装熟猪肉9批，预包装猪肉脯4批，预包装生制香肠8批，烤鸭、烤鸡共8批。采用建立的方法对所购样品进行测试，其中一批散装熟猪肉及散装熟牛肉中检出刚果红，其含量分别为46.5mg/kg 及295.1 mg/kg， 其余样品均未检出。 3 结 论 本文建立了肉制品中工业染料刚果红的 RRLC -MS/MS 快速检测方法。实验证明，该方法快速、准确、有效，操作性强，可作为食品安全监管的有力手段推广使用。该方法的建立将在很大程度上有效打击刚果红的非法添加使用，保证广大群众的食品安全。 ( 参考文献： ) ( Wikimedia F oundation. 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