通过优化保健品中L-羟脯氨酸的测定条件,建立保健品中L-羟脯氨酸的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量检测的分析方法。方法采用酸水解的方法处理L-羟脯氨酸, 色谱柱(EC-C18,4.6 mm x 50 mm, 2.7µm), 流动相为水相和乙腈按一定的梯度进行洗脱, 流速0.5 mL/min, 采用LC-MS/MS在正离子模式下检测, 外标法定量。高效液相色谱串联质谱法灵敏度高、 准确、 重现性好, 适用于保健品中L-羟脯氨酸的含量测定。
食品安全质量检测学报Journal of Food Safety and QualityVol.6 No. 2Feb.,2015第6卷第2期2015年2月 食品安全质量检测学报第6卷668 液相色谱-串联质谱法测定保健品中L-羟脯氨酸含量 蔡伟江*,陈晓霞 (汤臣倍健股份有限公司,珠海 519040) 摘 要 目的 通过优化保健品中L-羟脯氨酸的测定条件,建立保健品中L-羟脯氨酸的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量检测的分析方法。方法 采用酸水解的方法处理L-羟脯氨酸,色谱柱(EC-C18,4.6 mmx50 mm,2.7 um), 流动相为水相和乙腈按一定的梯度进行洗脱,流速0.5 mL/min, 采用 LC-MS/MS 在正离子模式下检测,外标法定量。结果 LC-MS/MS 法在 0.00284 mg/mL~0.0284 mg/mL 范围内,L-羟脯氨酸的浓度和峰面积的线性良好,相关系数R’>0.99,方法的检出限和定量限分别为 1.42pg/g 和 4.7 ug/g, 放置24h内L-羟脯氨酸的稳定性良好,在不同添加水平下,方法的回收率范围为95.0%~98.8%,相对标准偏差为1.7%(n=9)。结论 高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高、准确、重现性好,适用于保健品中L-羟脯氨酸的含量测定。 关键词 L-羟脯氨酸;保健品;液相色谱-串联质谱法;含量测定 L CAI Wei-Jiang, CHEN Xiao-Xia (By-Health Co., Ltd., Zhuhai 519040, China) By optimizing the determination conditions of L-hydroxyproline in health foods, toestablish a method for quantitative determination of L-hydroxyproline by liquid chromatography-tandem massspectrometry (LC-MS/MS) L-hydroxyproline was of acid hydrolysis and chromatographic analysiswas performed on column (EC-C18, 4.6 mm×50 mm, 2.7 um) eluted with an acetonitrile-water flow rate of 0.5mL/min, which was detected by LC-MS/MSin the positive ion mode and quantified by external standardmethod. The linear relationship between L-hydroxyproline concentration and peak area were goodwithin 0.00284~0.0284 mg/mL range, R>0.99, the detection limit and the limits of quantification were 1.42ug/g and 4.7 ug/g, with a good stability ofL-hydroxyproline within 24 h, and the recovery of different addinglevels was 95.0%~98.8%, and the relative standard deviation was 1.7%(n=9). High performanceliquid chromatography-tandem mass spectrometry method is sensitive, accurate, reproducible, and applicable tothe determination of L-hydroxyproline content in health foods. L-hydroxyproline; health care products; liquid chromatography-tandem mass spectrometry;. content determination ( *通讯作者 .蔡伟江,中药师,主 要 研究方 向 为保健 食 品的质量检测。E - mail: 714524253@qq.com CA I Wei-Jiang, H erbalists, By-Health Co. , Ltd . , Zhuhai 519040, China.E-mail: 714524253 @ qq.com ) 引 言 L-羟脯氨酸是一种亚氨基酸,通常在脯氨酸的第4位上带有羟基(见图1),但有时也在第3位上"。为白色片状结晶性或结晶性粉末,呈苦味中的独特甜味,能改善果汁饮料、清凉饮料等的风味的味质。有特殊风味,可作香原料。分子式: C5HNO3,分子量131.13。熔点274℃。易溶于水,微溶于乙醇。L-羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分,由测定的羟脯氨酸乘以一定的系数就可以得到胶原蛋白的含量,测定羟脯氨酸的方法有多种,而这些方法既有测定复合型的L-羟脯氨酸也有测定游离型的L-羟脯氨酸,其中包括分光光度法[2.3,4]、氨基酸分析仪法[5.6]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)17.8和比色法等,其中以分光光度法最为常见,如测定动物组织10]、猪肉叮]、胶原海绵2和鱼皮13]中羟脯氨酸的含量。紫外分光光度法虽然简单,但会受基质的不同而影响,氨基酸分析仪法和液相法,检测的时间一般会比较长。为了能在短时间内检测L-羟脯氨酸,本文探讨了高效夜相色谱串联质谱法检测L-羟脯氨酸的含量,同时通过酸水解对样品的处理,能把保健品里总的L-羟脯氨酸一起检测出来,该方法简便、高效、准确。 图14-羟脯氨酸的结构式 Fig.1 Structure of 4-hydroxyproline 材料与方法 仪器和试剂 L-羟脯氨酸标准品(来源: Sigma; 批号:MKBH 0984V,纯度:100%);乙腈(色谱纯, CNW);乙酸铵(色谱纯, CNW);甲酸(色谱纯, CNW);蒸馏水;胶原蛋白口服液(汤臣倍健股份有限公司)。 超声波清洗器(EQ-500,昆山市超声仪器有限公司);高效液相色谱仪(美国安捷伦1260);色谱柱(EC-C18,4.6 mmx50 mm, 2.7 pm, 美国安捷伦);质谱(API3200,美国AB公司)。 色谱条件 流动相:水水(称取0.771g乙酸铵加水1.0L溶解,用乙酸调 pH=3.5,过滤,即得。)和乙腈,流动相梯度见表1;流速: 0.4 mL/min;柱温:40℃;时间:9min; 进样量:5pL。 表 流动相梯度表 时间(min) 0.01 mol/L 乙酸铵 乙腈 0.00 90 10 5.00 75 25 5.01 90 10 9.00 90 10 质谱条件 (1) 以电喷雾离子源(ESI)阳离子模式,气帘气20 psi; 碰撞气6 psi; 喷雾电压5500V;离子源温度600℃;雾化气 50 psi; 辅助气 50 psi; 时间9 min。 (2)L-羟脯氨酸质谱参数,见表2。 标准品溶液的配制 精确称取L-羟脯氨酸标准品 5.68 mg 于100 mL棕色容量瓶中,加 0.1%的甲酸水容液定容至刻度,超声,摇匀,放在4℃的冰箱中储存备用。分别精密移取L-羟脯氨酸标准贮备液5.0、10.0、15.0、20.0、50.0 mL 于100 mL棕色容量瓶中,加0.1%的甲酸水溶液定容至刻度,摇匀,经0.45 um 的微孔滤膜过滤,进样量为5 pL, 以浓度 C(mg/mL)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,绘制标准工作曲线。 表 L-羟脯氨酸的质谱 监测条件 母离子 子离子 采集时间(ms) 锥孔电压(V) 入口电压(V) 碰撞能量(eV) 出口电压(V) 132.07 86.1 150 36 6 23 4 132.07 68.0 150 36 6 29 14 132.07为母离子碎片,86.1为定量离子碎片,68.0为定性离子碎片。 供试品溶液的制备 精密称取适量样品,置于 25 mL 磨口具塞比色管内,加6 mol/L 盐酸15 mL, 加入0.2g苯酚,用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解,充氮气,盖紧塞子,置于110℃±1℃的恒温干燥箱内,水解22 h,取出冷却,过滤,用蒸馏水冲洗比色管,将水解液全部转移至50mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀。精密吸取水解液1.0 mL于10 mL容量瓶中,置于真空干燥箱内,于40℃~50℃减压干燥(真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂),干燥后残留物用 0.1%的甲酸水溶液定容至刻度,摇匀,经0.45 um 的微孔滤膜过滤,即为供试品溶液,取滤液进样5 uL。 线性实验 将标准品贮备液分别稀释成:0.00284、0.00568、0.00852、0.01136、0.0284 mg/mL 5个浓度,经0.45 um的微孔滤膜过滤,每个浓度农 5 uL注入色谱系统。 精密度实验 称取6份样品,按2.5试样制备方法处理样品,检测样品含量,计算其 RSD(%)。 加标回收率实验 精密称取适量样品,共9份,置于25 mL磨口的具塞比色管内,分成3组,每组3份,于每一组中分别加 羟脯氨酸标准品2.18、3.22、3.76 mg, 加6 mol/L盐酸15 mL, 加入0.2g苯酚,用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解,充氮气,盖紧塞子,置于110℃±1℃的恒温干燥箱内,水解22h,取出冷却,过滤,用蒸馏水冲洗比色管。将水解液全部转移至50mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,精密吸取1.0 mL于10mL 容量瓶中,置于真空干燥箱内,于40℃~50℃减压干燥(真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂),干燥后残留物用0.1%的甲酸水溶液定容至刻度,摇匀,经0.45 p.m 的微孔滤膜过滤,即为供试品溶液,取滤液进样5 pL。 稳定性试验 取L-羟脯氨酸标准品液(浓度为 0.00852 mg/mL)分别在室温下放置0、2、4、8、12、24h后进样,进样量为5pL,计算其峰面积的相对标准偏差RSD(%),考察该方法的稳定性。 结果与讨论 色谱行为 采用液相质谱联用法能快速检测保健品中L-羟脯氨酸,不会因为其他因素而影响检测。采用水相和乙腈按一定的梯度进行洗脱, 9 min 就能把样品中L-羟脯氨酸流出。通过 LC-MS/MS 在正离子模式下检测,能达到准确的分离和定量,见图2和图3. 图2L-羟脯氨酸标准品的质谱峰图 Fig.22L-hydroxyproline standard of mass spectrum peak figure 图3 样品的质谱峰图 Fig.3 The mass spectrum peak figure of the sample 线性实验 线性实验结果如表3所示,相关系数R为1.0000,所以用该方法测定L-羟脯氨酸的含量,在浓度为0.00284 mg/mL~0.0284 mg/mL之间呈现良好的线性。 表 线性实验结果 序号 浓度C(mg/mL) 羟脯氨酸峰面积(A) STD1 0.00284 277000 STD2 0.00568 539000 STD3 0.00852 802000 STD4 0.01136 1070000 STD5 0.0284 2680000 线性方程 A=9.42e+007X+3880 相关系数(R) 1.0000 检出限和定量限实验 分析方法的检出限 DL 和定量限QL 由信噪比(S/N)计算。DL定义为 S/N=3时对应的待分析物浓度,QL 定义为 S/N=10时对应的分析物浓度。 3.3.1 检出限 精密量取浓度为 0.00284 mg/mL 的羟脯氨酸工作标准溶溶1.0mL于100mL棕色瓶中,定容至刻度,即得浓度为 0.0284 ug/mL 的标准品溶液,再取该浓度的羟脯氨酸标准液3 mL于 25mL 棕色容量瓶中,定容至刻度,摇匀,即得浓度为:0.003408 pg/mL 的溶液,以S/N=3 定方法的检出限浓度, DL=0.003408ug/mL,按实际样品的处理过程计算,方法的检出限为:0.003408ug/mLx500 mL/1.2g=1.42 ug/g. 3.3.2 定量限 以 S/N=10定方法的检测浓度为: QL=0.003408ug/mL/3×10=0.01136 pg/g, 按实际样品的处理过程计算,方法的定量限为:1.42 ug/gx10/3=4.7 pg/g。 精密度实验 从表4中可以看出,6个胶原口服液的样品的含量范围为315.584 mg/100mL~336.563 mg/100mL, 平均含量是327 mg/100 mL, 相对标准偏差(RSD)为2.8%,具有良好的精密度。 稳定性试验 L-羟脯氨酸标准溶液分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h,其峰面积的RSD(%)为:1.5%,表明L-羟脯氨酸标准溶液在室温下24h 内的稳定性较好。 表 精密度的实验结果 序号 称样量(g) 浓度(mg/mL) 含量(mg/100mL) 平均含量(mg/100 mL) RSD(%) 1 2.0013 0.012 315.584 2 2.1302 0.0133 328.607 3 2.0115 0.0127 332.299 327.00 2.8 4 2.0218 0.0128 333.210 5 2.1424 0.0137 336.563 6 2.0002 0.012 315.757 表 加标回收率实验结果 序号 样品称样量(g) 样品占量(mg/100 mL) 测得对照品量(mg) 加标量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 1.9707 437.995 2.078020 2.18 95.322 2 2.0429 437.973 2.153731 2.18 98.795 3 2.0434 437.866 2.152178 2.18 98.723 4 2.0617 487.589 3.145329 3.22 97.681 5 2.0521 489.870 3.175151 3.22 98.607 96.86 1.7 6 2.0535 486.973 3.120802 3.22 96.919 7 1.9836 517.400 3.587947 3.76 95.424 8 1.9702 518.248 3.579574 3.76 95.201 9 1.9721 517.748 3.573671 3.76 95.044 加标回收率实验 从表5中可以看出,在不同添加水平下,保健品中L-羟阴氨酸方法的回收率范围为 95.0%~98.8%,平均回收率为96.86%,相对标准偏差(RSD)为1.7%。 结 论 本文通过对样品进行酸水解的前处理,采用0.01mol/L 乙酸铵和乙腈作为流动相,按一定的梯度经安捷伦色谱柱(EC-C18, 4.6 mmx50 mm, 2.7 pm),采用液相-串联质谱法,能很快分离保健品中L-羟脯氨酸,并进行定量检测。通过测定其线性范围、检出限、定量限、精密度、稳定性和回收率实验,结果令人满意。表明该方法适用于测定保健品中L-羟脯氨酸的含量检测。 ( 参考文献 ) ( [1]夏金根, 陈 波,姚守 拙. 高效液相色 谱 -质谱联用测定胶原蛋 白 中的羟脯氨酸[ J ].色谱, 2 00 8, 26(5):595-5 9 8. ) ( Xia J G, Chen B, Y a o S C . 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