保健品中L-羟脯氨酸含量检测方案(二手分析仪器)

食品安全质量检测学报Journal of Food Safety and QualityVol.6 No. 2Feb.，2015第6卷第2期2015年2月 食品安全质量检测学报第6卷668 液相色谱-串联质谱法测定保健品中L-羟脯氨酸含量 蔡伟江*，陈晓霞 (汤臣倍健股份有限公司，珠海 519040) 摘 要 目的 通过优化保健品中L-羟脯氨酸的测定条件，建立保健品中L-羟脯氨酸的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量检测的分析方法。方法 采用酸水解的方法处理L-羟脯氨酸，色谱柱(EC-C18，4.6 mmx50 mm，2.7 um)， 流动相为水相和乙腈按一定的梯度进行洗脱，流速0.5 mL/min， 采用 LC-MS/MS 在正离子模式下检测，外标法定量。结果 LC-MS/MS 法在 0.00284 mg/mL~0.0284 mg/mL 范围内，L-羟脯氨酸的浓度和峰面积的线性良好，相关系数R’>0.99，方法的检出限和定量限分别为 1.42pg/g 和 4.7 ug/g， 放置24h内L-羟脯氨酸的稳定性良好，在不同添加水平下，方法的回收率范围为95.0%~98.8%，相对标准偏差为1.7%(n=9)。结论 高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高、准确、重现性好，适用于保健品中L-羟脯氨酸的含量测定。 关键词 L-羟脯氨酸；保健品；液相色谱-串联质谱法；含量测定 L CAI Wei-Jiang， CHEN Xiao-Xia (By-Health Co.， Ltd.， Zhuhai 519040， China) By optimizing the determination conditions of L-hydroxyproline in health foods， toestablish a method for quantitative determination of L-hydroxyproline by liquid chromatography-tandem massspectrometry (LC-MS/MS) L-hydroxyproline was of acid hydrolysis and chromatographic analysiswas performed on column (EC-C18， 4.6 mm×50 mm， 2.7 um) eluted with an acetonitrile-water flow rate of 0.5mL/min， which was detected by LC-MS/MSin the positive ion mode and quantified by external standardmethod. The linear relationship between L-hydroxyproline concentration and peak area were goodwithin 0.00284~0.0284 mg/mL range， R>0.99， the detection limit and the limits of quantification were 1.42ug/g and 4.7 ug/g， with a good stability ofL-hydroxyproline within 24 h， and the recovery of different addinglevels was 95.0%~98.8%， and the relative standard deviation was 1.7%(n=9). High performanceliquid chromatography-tandem mass spectrometry method is sensitive， accurate， reproducible， and applicable tothe determination of L-hydroxyproline content in health foods. L-hydroxyproline； health care products； liquid chromatography-tandem mass spectrometry；. content determination ( *通讯作者 .蔡伟江，中药师，主 要 研究方 向 为保健 食 品的质量检测。E - mail： 714524253@qq.com CA I Wei-Jiang， H erbalists， By-Health Co. ， Ltd . ， Zhuhai 519040， China.E-mail： 714524253 @ qq.com ) 引 言 L-羟脯氨酸是一种亚氨基酸，通常在脯氨酸的第4位上带有羟基(见图1)，但有时也在第3位上"。为白色片状结晶性或结晶性粉末，呈苦味中的独特甜味，能改善果汁饮料、清凉饮料等的风味的味质。有特殊风味，可作香原料。分子式： C5HNO3，分子量131.13。熔点274℃。易溶于水，微溶于乙醇。L-羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分，由测定的羟脯氨酸乘以一定的系数就可以得到胶原蛋白的含量，测定羟脯氨酸的方法有多种，而这些方法既有测定复合型的L-羟脯氨酸也有测定游离型的L-羟脯氨酸，其中包括分光光度法[2.3，4]、氨基酸分析仪法[5.6]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)17.8和比色法等，其中以分光光度法最为常见，如测定动物组织10]、猪肉叮]、胶原海绵2和鱼皮13]中羟脯氨酸的含量。紫外分光光度法虽然简单，但会受基质的不同而影响，氨基酸分析仪法和液相法，检测的时间一般会比较长。为了能在短时间内检测L-羟脯氨酸，本文探讨了高效夜相色谱串联质谱法检测L-羟脯氨酸的含量，同时通过酸水解对样品的处理，能把保健品里总的L-羟脯氨酸一起检测出来，该方法简便、高效、准确。 图14-羟脯氨酸的结构式 Fig.1 Structure of 4-hydroxyproline 材料与方法 仪器和试剂 L-羟脯氨酸标准品(来源： Sigma； 批号：MKBH 0984V，纯度：100%)；乙腈(色谱纯， CNW)；乙酸铵(色谱纯， CNW)；甲酸(色谱纯， CNW)；蒸馏水；胶原蛋白口服液(汤臣倍健股份有限公司)。 超声波清洗器(EQ-500，昆山市超声仪器有限公司)；高效液相色谱仪(美国安捷伦1260)；色谱柱(EC-C18，4.6 mmx50 mm， 2.7 pm， 美国安捷伦)；质谱(API3200，美国AB公司)。 色谱条件 流动相：水水(称取0.771g乙酸铵加水1.0L溶解，用乙酸调 pH=3.5，过滤，即得。)和乙腈，流动相梯度见表1；流速： 0.4 mL/min；柱温：40℃；时间：9min； 进样量：5pL。 表 流动相梯度表 时间(min) 0.01 mol/L 乙酸铵 乙腈 0.00 90 10 5.00 75 25 5.01 90 10 9.00 90 10 质谱条件 (1) 以电喷雾离子源(ESI)阳离子模式，气帘气20 psi； 碰撞气6 psi； 喷雾电压5500V；离子源温度600℃；雾化气 50 psi； 辅助气 50 psi； 时间9 min。 (2)L-羟脯氨酸质谱参数，见表2。 标准品溶液的配制 精确称取L-羟脯氨酸标准品 5.68 mg 于100 mL棕色容量瓶中，加 0.1%的甲酸水容液定容至刻度，超声，摇匀，放在4℃的冰箱中储存备用。分别精密移取L-羟脯氨酸标准贮备液5.0、10.0、15.0、20.0、50.0 mL 于100 mL棕色容量瓶中，加0.1%的甲酸水溶液定容至刻度，摇匀，经0.45 um 的微孔滤膜过滤，进样量为5 pL， 以浓度 C(mg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准工作曲线。 表 L-羟脯氨酸的质谱 监测条件 母离子 子离子 采集时间(ms) 锥孔电压(V) 入口电压(V) 碰撞能量(eV) 出口电压(V) 132.07 86.1 150 36 6 23 4 132.07 68.0 150 36 6 29 14 132.07为母离子碎片，86.1为定量离子碎片，68.0为定性离子碎片。 供试品溶液的制备 精密称取适量样品，置于 25 mL 磨口具塞比色管内，加6 mol/L 盐酸15 mL， 加入0.2g苯酚，用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解，充氮气，盖紧塞子，置于110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解22 h，取出冷却，过滤，用蒸馏水冲洗比色管，将水解液全部转移至50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密吸取水解液1.0 mL于10 mL容量瓶中，置于真空干燥箱内，于40℃~50℃减压干燥(真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂)，干燥后残留物用 0.1%的甲酸水溶液定容至刻度，摇匀，经0.45 um 的微孔滤膜过滤，即为供试品溶液，取滤液进样5 uL。 线性实验 将标准品贮备液分别稀释成：0.00284、0.00568、0.00852、0.01136、0.0284 mg/mL 5个浓度，经0.45 um的微孔滤膜过滤，每个浓度农 5 uL注入色谱系统。 精密度实验 称取6份样品，按2.5试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其 RSD(%)。 加标回收率实验 精密称取适量样品，共9份，置于25 mL磨口的具塞比色管内，分成3组，每组3份，于每一组中分别加 羟脯氨酸标准品2.18、3.22、3.76 mg， 加6 mol/L盐酸15 mL， 加入0.2g苯酚，用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解，充氮气，盖紧塞子，置于110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解22h，取出冷却，过滤，用蒸馏水冲洗比色管。将水解液全部转移至50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，精密吸取1.0 mL于10mL 容量瓶中，置于真空干燥箱内，于40℃~50℃减压干燥(真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂)，干燥后残留物用0.1%的甲酸水溶液定容至刻度，摇匀，经0.45 p.m 的微孔滤膜过滤，即为供试品溶液，取滤液进样5 pL。 稳定性试验 取L-羟脯氨酸标准品液(浓度为 0.00852 mg/mL)分别在室温下放置0、2、4、8、12、24h后进样，进样量为5pL，计算其峰面积的相对标准偏差RSD(%)，考察该方法的稳定性。 结果与讨论 色谱行为 采用液相质谱联用法能快速检测保健品中L-羟脯氨酸，不会因为其他因素而影响检测。采用水相和乙腈按一定的梯度进行洗脱， 9 min 就能把样品中L-羟脯氨酸流出。通过 LC-MS/MS 在正离子模式下检测，能达到准确的分离和定量，见图2和图3. 图2L-羟脯氨酸标准品的质谱峰图 Fig.22L-hydroxyproline standard of mass spectrum peak figure 图3 样品的质谱峰图 Fig.3 The mass spectrum peak figure of the sample 线性实验 线性实验结果如表3所示，相关系数R为1.0000，所以用该方法测定L-羟脯氨酸的含量，在浓度为0.00284 mg/mL~0.0284 mg/mL之间呈现良好的线性。 表 线性实验结果 序号 浓度C(mg/mL) 羟脯氨酸峰面积(A) STD1 0.00284 277000 STD2 0.00568 539000 STD3 0.00852 802000 STD4 0.01136 1070000 STD5 0.0284 2680000 线性方程 A=9.42e+007X+3880 相关系数(R) 1.0000 检出限和定量限实验 分析方法的检出限 DL 和定量限QL 由信噪比(S/N)计算。DL定义为 S/N=3时对应的待分析物浓度，QL 定义为 S/N=10时对应的分析物浓度。 3.3.1 检出限 精密量取浓度为 0.00284 mg/mL 的羟脯氨酸工作标准溶溶1.0mL于100mL棕色瓶中，定容至刻度，即得浓度为 0.0284 ug/mL 的标准品溶液，再取该浓度的羟脯氨酸标准液3 mL于 25mL 棕色容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得浓度为：0.003408 pg/mL 的溶液，以S/N=3 定方法的检出限浓度， DL=0.003408ug/mL，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.003408ug/mLx500 mL/1.2g=1.42 ug/g. 3.3.2 定量限 以 S/N=10定方法的检测浓度为： QL=0.003408ug/mL/3×10=0.01136 pg/g， 按实际样品的处理过程计算，方法的定量限为：1.42 ug/gx10/3=4.7 pg/g。 精密度实验 从表4中可以看出，6个胶原口服液的样品的含量范围为315.584 mg/100mL~336.563 mg/100mL， 平均含量是327 mg/100 mL， 相对标准偏差(RSD)为2.8%，具有良好的精密度。 稳定性试验 L-羟脯氨酸标准溶液分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h，其峰面积的RSD(%)为：1.5%，表明L-羟脯氨酸标准溶液在室温下24h 内的稳定性较好。 表 精密度的实验结果 序号 称样量(g) 浓度(mg/mL) 含量(mg/100mL) 平均含量(mg/100 mL) RSD(%) 1 2.0013 0.012 315.584 2 2.1302 0.0133 328.607 3 2.0115 0.0127 332.299 327.00 2.8 4 2.0218 0.0128 333.210 5 2.1424 0.0137 336.563 6 2.0002 0.012 315.757 表 加标回收率实验结果 序号 样品称样量(g) 样品占量(mg/100 mL) 测得对照品量(mg) 加标量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 1.9707 437.995 2.078020 2.18 95.322 2 2.0429 437.973 2.153731 2.18 98.795 3 2.0434 437.866 2.152178 2.18 98.723 4 2.0617 487.589 3.145329 3.22 97.681 5 2.0521 489.870 3.175151 3.22 98.607 96.86 1.7 6 2.0535 486.973 3.120802 3.22 96.919 7 1.9836 517.400 3.587947 3.76 95.424 8 1.9702 518.248 3.579574 3.76 95.201 9 1.9721 517.748 3.573671 3.76 95.044 加标回收率实验 从表5中可以看出，在不同添加水平下，保健品中L-羟阴氨酸方法的回收率范围为 95.0%~98.8%，平均回收率为96.86%，相对标准偏差(RSD)为1.7%。 结 论 本文通过对样品进行酸水解的前处理，采用0.01mol/L 乙酸铵和乙腈作为流动相，按一定的梯度经安捷伦色谱柱(EC-C18， 4.6 mmx50 mm， 2.7 pm)，采用液相-串联质谱法，能很快分离保健品中L-羟脯氨酸，并进行定量检测。通过测定其线性范围、检出限、定量限、精密度、稳定性和回收率实验，结果令人满意。表明该方法适用于测定保健品中L-羟脯氨酸的含量检测。 ( 参考文献 ) ( [1]夏金根， 陈 波，姚守 拙. 高效液相色 谱 -质谱联用测定胶原蛋 白 中的羟脯氨酸[ J ].色谱， 2 00 8， 26(5)：595-5 9 8. ) ( Xia J G， Chen B， Y a o S C . 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