种植作物中农药残留检测方案(二手分析仪器)

GC/MS/MS 法定量和重复性分析种植作物中的痕量农残 应用报告 食品安全 摘要 作者 Limian Zhao & Chin-Kai Meng 使用 GC/MS/MS法对6种不同种植作物萃取液中的33种代表性农残进行了多组分的痕量分析，样品前处理采用 QuEChERS 法。 安捷伦科技有限公司 Centerville路2850号 威明顿 特拉华州19808 该报告显示，对于大多数农残，得到了1ng/mL甚至更低的定量限LOQ， 在1ng/mL到100 ng/mL的范围内存在良好线性，并且以 10 ng/mL的基质溶液连续10次进样显示出优异的重复性。 美国 前言 水果、蔬菜和其他食品的多组分农残分析在样品制备和分析测定上一直具有相当的挑战性。很多农残的定量限都要求低于10 ng/mL (ppb)，这无疑会使分析过程更加复杂。 与应用广泛的 GC/MS 分析技术相比， GC/MS/MS 技术能提供更高的选择性，因而可以显著降低系统的检出限。安捷伦7890/7000 GC/MS 三重四级杆(GC/QQQ)分析仪可以提供供含超过 1000种农残和环境污染物的MRM 数据库(p/n G9250AA)， 可以对复杂基质中目标农残进行分析，从而简化分析过程、提高分析效率。 QuEChERS 样品制备技术于 2003年被 USDA 的科学家首次应用到食品农残分析领域[1]。因其快速、简单、经济、高效、稳定和安全的特性，该技术迅速被全世界接受并用于多组分农残分析。QuEChERS 萃取液可以通过 LC 和 GC 结合 MS分析，实现宽范围的农残测定。对不同食品基质中常用农残成分的分析应用证明安捷伦 QuEChERS 萃取试剂盒和分散型 SPE 净化试剂盒在样品处理方面拥有优异的回收率[2、3]。然而，通过QuEChERS 方法提取的食物萃取液组分仍旧十分复杂，其中还包含了很多高沸点的基质本体残留物。 用于 GC/MS分析的 QuEChERS 萃取液会污染并损坏 GC色谱柱和MS离子源，糟糕的峰形和活性组分响应的损失会导致非常不理想的数据结果，还会缩短色谱分析柱的寿命，增加质谱维护成本。因此，为了获得可靠的结果，并保护色谱分析柱和质谱的离子源，使用最好的仪器和消耗品是非常有必要的。 色谱柱的反吹功能能够为食品萃取液的分析带来很多好处，该功能可显著缩短分析周期，降低色谱柱头切割和质谱离子源清洗的频率[4]。安捷伦的微板流路控制技术(CFT)使色谱柱的反吹成为常规操作[5、6]。 安捷伦新的超高惰性去活化技术显著提高了玻璃棉衬管的惰性和耐用性。玻璃棉表面被彻底去活化。装有玻璃棉的超高惰性不分流衬管在对水果和蔬菜中的活性物质和难分析物质的定量分析方面表现出了卓越的惰性。装有玻璃棉的超高惰性衬管同样还能更好地保护样品流路，延长色谱柱的寿命，减少质谱离子源的维护频率[7]. 实验 选择了33种有挑战的代表性农残，对6种种植作物基质进行痕量加标分析。在作物的空白基质中加入农残标准液，准 QuEChERSAOAC 方法进行萃取[1-3]，然后使用 GC/MS/MS在多反应监测(MRM)模式下对萃取液进行分析。对校准曲线1-100 ng/mL 的浓度范围进行线性评估。10 ng/mL 的质控(QC)样品用于测试分析重复性。并使用四根衬管进行衬管间重现性测试。 化学品和试剂 所有试剂和溶剂均为 HPLC 级或者分析纯级。乙腈(AcN) 来自于Honeywell B&J (Muskegon， MI， USA)。 Ultra Resi-analyzed 级丙酮来自 J.T.Baker (Phillipsburg， NJ， USA)。乙酸来自 SigmaAldrich (St Louis， MO， USA)。农残标准品和内标物(磷酸三苯酯， TPP) 购自 SigmaAldrich (St Louis， MO， USA)， ChemService (West Chester，PA， USA) 或者 Ultra Scientific (NorthKingstown，RI， USA)。 溶液与标液 向 100 mL乙腈中加入1mL冰醋酸制成含1%乙酸的乙腈试剂空白溶液，该溶液也在 QuEChERS 法中作为萃取溶剂。 农残各组分标准贮备液以丙酮为溶剂，浓度为 2 mg/mL， -20℃存放。将33种农残的标准贮备液用丙酮进行稀释，配成浓度均为20 pg/mL 的混合标液，4℃存放。为了减少校准标液中基质的稀释倍数，临用时，以 20 pg/mL的混标为基础，在基质空白溶液中配制浓度为 500 ng/mL的加标中间液，随后配制成浓度分别为1、5、10、50和100 ng/mL的基质匹配校准标液和10ng/mL的质控(QC)标液。 以丙酮为溶剂配制浓度为 2 mg/mL 的磷酸三苯酯 (TPP) 内标(IS)储备液。将 IS 贮备液用乙腈稀释配制成 20 pg/mL 的 IS加标液，并于4°℃冷藏保存。向所有样品中加入适量体积的 IS加标液，使其浓度为100 ng/mL。 基质空白制备 本报告选择面粉、草莓、梨、橙子、辣椒和菠菜这6种食品作为基质样品。详细的萃取过程在安捷伦应用报告中有所描述[2、3]。水果和蔬菜经冷冻切碎后，进行彻底匀浆。随后，用15mL含1%乙酸的乙腈对15g混匀的样品(除面粉外)进行萃取，再加入BondElut QuEChERS AOAC 萃取盐试剂包 (p/n 5982-5755)使基质组分分离进入到水相。对于面粉，在10mL水中加入5g混匀的样品，浸泡过夜，依照QuEChERS 过程进行萃取。离心后，取出上清液，并使用通用分散型SPE 试剂盒 (p/n 5982-5022) 进行样品净化。涡旋和离心后，将上清液转移到样品瓶中作为基质空白进行后续实验。所有食品的基质空白都置于4°℃冷藏保存。 仪器 所有的分析进程均由配备了安捷伦7693B 自动进样器的安捷伦7890 GC 和7000系列 GC/MS 三重四级杆系统完成[7]。使用安捷伦超高惰性性相色谱柱 HP5MS UI 对组分进行分离，并在进入检测器前提供高惰性的样品流路。表1列出了本报告所用的仪器参数。表2列出了本报告所用的耗材列表。表3列出了33种目标化合物的 MRM 设置。直接使用安捷伦 MRM 数据库(p/nG9250AA) 建立目标物的MS 采集方法。 使用反吹功能可以缩短高沸点基质残留样品的分析时间，降低系统的维护频率[2、4]。本报告中的仪器配置除无保留间隙柱外，其他均与安捷伦先前报告中图1B的配置相似[4]。采用保留时间锁定 (RTL) 功能无需对 MRM 离子对的保留时间进行再校正[6]。运行时间为 23 min， 附加反吹时间为2 min。每种农残都选用两个 MRM 跃迁来进行定量和定性分析。然而，为减小基质效应，对不同的基质需要选择不同的跃迁进行定量分析。因此，针对某一基质设定定量方法前对该基质的分析数据进行详细审查是非常关键的。 表1. 安捷伦 GC/MS/MS 系统的仪器参数 表2. 耗材和备件 样品瓶 琥虎色，带书写签，100个/包 (p/n 5182-0716) 样品瓶盖 蓝色螺纹口瓶盖，100个/包(p/n 5182-0717) 样品瓶内插管 150pL玻璃带聚合物支脚， 100个/包(p/n 5183-2088) 隔垫 高级绿色不粘连， 11 mm， 50个/包 (p/n 5183-4759) 垫圈 0.4 mm 内径， 聚酰亚按/石墨(85/15)， 10个/包(p/n 5181-3323) 衬管0形圈 不粘连衬管0形圈，10个/包(p/n 5188-5365) 微板流路控制技术 Purged Utimate Union (p/n G3182-61580) 内螺母，1个/包(p/n G2855-20530) SilTite 金属垫圈，用于 0.10-0.25 mm内径色谱柱， 进样口衬管 10个/包 (p/n5188-5361) 安捷伦超高惰性去活单锥不分流衬管，带玻璃棉，1个/包 (p/n 5190-2293)，5个/包(p/n 5190-3163) 表3. 33种农残的定量和定性 MRM 跃迁 结果和讨论 该报告的目的是为了评估使用 GC/MS/MS对6种不同基质(梨、橙子、草莓、面粉、辣椒和菠菜)中的代表性农残进行痕量分析的性能，填充了高效去活化玻璃棉的安捷伦超高惰性衬管在分析过程中表现出了卓越的惰性，同时也有效地保护了色谱柱和质谱离子源，使农残样品，特别是活性非常高的农残样品获得了更好的峰形和更一致的响应[7]。本报告同时还对超高惰性玻璃棉衬管和 SiltekCyclosplitter 衬管的峰形和响应重复性进行了比较。 所有指标均在6种食品基质上完成。有关基质对系统稳定性的干扰和影响等基质效应也是本报告的研究内容之一。某些农残在不同基质中响应一致，但大多数农残由于基质增强效应或者基质抑制效应，在不同的基质中具有不同的响应。因此，为使定量结果准确，很有必要采用基质匹配的校准曲线。 本报告评估的系统性能包括：1到100 ng/mL 范围内的线性；定量限(LOQ) ； 10ng/mL 的进样重复性和不同衬管间的重现性。 测试序列包括不同基质中浓度为 10 ng/mL的 QC样品各10次进样，顺序依次为橙子、梨、草莓、面粉、辣椒和菠菜；还包括校准标样和基质空白。每根测试衬管在一个序列中都需注射80多个样品。因为氧化乐果受基质抑制作用明显，所以该分析物是最具挑战性的农残之一，在图1中可作为验证超高惰性玻璃棉衬管优越性的代表物质。 图1. 氧化乐果在超高惰性玻璃棉单锥衬管和 Restek Siltek Cyclosplitter 双锥衬管上的出峰效果比较。样品浓度为10ng/mL(各基质中农残混合物浓度) 梨中农残的痕量分析 图2所示为梨基质空白溶液和 1 ng/mL 梨基质加标溶液在GC/QQQ上采集得到的 MRM 色谱图。即使根据基质对 MRM跃迁进行了慎重选择，在某些MRM 跃迁中，梨的基质空白仍存在一些干扰峰。大多数干扰峰可以被色谱成功分离，不会影响定量结果。然而，在与甲胺磷相同的保留时间处存在一个干扰峰，该干扰峰使目标物的定量限提高到了 5 ng/mL。同羊，邻苯基苯酚也因为受到了干扰峰的影响，定量限提高到5ng/mL。图2中所示的氧化乐果和异狄氏剂酮的响应值比较低，但它们在1ng/mL时 的信噪比尚令人满意。溴氰菊酯的响应一直很低，虽然在1 ppb 的信噪比为3，但将定量限定为5 ng/mL 更合理些。很多农残在梨基质中有令人满意的信噪比，定量限可低于1 ng/mL，这些农残在表4中已用星号“*”标出。表4列出了梨基质中除甲胺磷、邻苯基苯酚和溴氰菊酯以外其他30种农残的定量结果。这些农残在梨基质中的定量限量达到了1ng/mL， 甚至更低。10 ng/mL QC样品的10次进样重复性结果非常出色，包括氧化乐果，乙酰甲胺磷和 DDT这些最具挑战性的农残在内，这33种农残的 RSD 均小于15%。 图2. 梨基质空白和1 ng/mL 农残梨基质加标液的 GC/QQQ MRM 色谱图。峰识别请参照表3。由于低响应或者基质干扰，在梨基质中未能识别出1 ng/mL的甲胺磷(1)、邻苯基苯酚(5)和溴氰菊酯(33) 表4. 定量结果(梨基质) 10 ng/mL农残的梨基质加标溶液10次进样的RSD (%) *使用当前方法，可获得更更 LOQ的农残 橙子中农残的痕量分析 图3所示为橙子基质空白和1ng/mL橙子基质加标液的 GC/QQQMRM 色谱图。正如基质空白色谱图中所示，橙子基质中的干扰峰较少。溴氰菊酯附近的干扰峰并未影响溴氰菊酯的分析。虽然橙子基质空白中检出有邻苯基苯酚，但由于邻苯基苯酚的响应比较高，并且基质背景相对干净，邻苯基苯酚还是可以获得 1 ng/mL 的LOQ。除了溴氰菊酯的 LOQ 为5 ng/mL， 其他32种农残的 LOQ均达到1ng/mL。表 5中， LOQ 低于 1 ng/mL 的农残以“*”标出。表5所示为橙子基质的定量结果和良好的线性结果。10 ng/mLQC样品的10次进样重复性结果非常出色，大多数农残的 RSD均小于15%。而由于在橙基质中响应值的下的，10次进样 DDT 的RSD% 略高于15%。 图3. 橙子基质空白和1ng/mL农残橙子基质加标液的 GC/QQQ MRM 色谱图。峰识别请参照表3.由于低响应，在橙子基质中未能识别出1 ng/mL的溴氰菊酯 (33) 表5. 定量结果(橙子基质) 10 ng/mL 农残的橙子基质加标溶液10次进样的 RSD (%) *使用当前方法，可获得更更 LOQ的农残 草莓中农残的痕量分析 图4所示为草莓基质空白和 1 ng/mL 农残草莓基质加标液的GC/QQQ MRM 色谱图。对除邻苯基苯酚外的所有 MRM 跃迁，草莓基质空白的背景干扰都很低。邻苯基苯酚附近的基质干扰峰使其 LOQ提高到 5 ng/mL。 因为 1 ng/mL 样品产生的响应比较低，甲胺磷、氧化乐果和溴氰菊酯的 LOQ也为5ng/mL。表6中，LOQ 低于1 ng/mL 的农残已用“*”标出。表6列出了定量结果和良好的线性结果。大多数农残10 ng/mL QC样品10次重复性进样的 RSD 均小于 15%。氧化乐果的 RSD 大于20%。有趣的是，DDT 的重复性很好， RSD 小于10%。结果表明，不同基质对农残响应(MRM跃迁) 的影响不同。 计数 vs 采集时间(min) 图4. 草莓基基空白和1 ng/mL 农残草莓基质加标液的 GC/QQQ MRM 色谱图。峰识别请参照表3.由于低响应或者基质干扰，在草莓基质中未能识别出1 ng/mL的甲胺磷(1)、邻苯基苯酚(5)、氧化乐果(6)和溴氰菊菊(33) 表6. 定量结果(草莓基质) *使用当前方法，可获得更低 LOQ的农残 面粉中农残的痕量分析 图5所示为面粉基基空空和1ng/mL 农残面粉基质加标液的GC/QQQ MRM 色谱图。对除邻苯基苯酚外所有 MRM 跃迁，面粉基质空白的背景干扰都很低。由于甲萘威在面粉基质中的低响应， 其LOQ为5ng/mL。其他32种农残的 LOQ均达到1ng/mL。 对1 ng/mL的邻苯基苯酚，共流出物的干扰峰对其响应的贡献低于20%。面粉中甲胺磷、氧化乐果和溴氰菊酯均获得较理想的响应， LOQ达到1 ng/mL。 表7中LOQ低于1ng/mL的农残已用66×标出。表7列出了定量结果和良好的线性结果。所有农残10 ng/mL QC样品10次重复性进样的 RSD 均小于15%。 计数 vs 采集时间(min) 图5. 面粉基质空白和1 ng/mL农残面粉基质加标液的 GC/QQQ MRM 色谱图。峰识别请参照表3。由于低响应，在面粉基质中未能识别出1ng/mL 的甲萘威(14) 表7. 定量结果(面粉基质) 10 ng/mL 农残的面粉基质加标溶液10次进样的 RSD (%) *使用当前方法，可获得更更 LOQ的农残 辣椒中农残的痕量分析 图6所示为辣椒基质空白和 1 ng/mL 农残辣椒基质加标液的GC/QQQ MRM 色谱图。与面粉和草莓相同，辣椒基质空白对所有 MRM 跃迁的干扰均较小，虽然辣椒空白基质中检出邻苯基苯酚，但由于邻苯基苯酚的高响应和低干扰的基质背景，邻苯基苯酚的 LOQ仍可达1 ng/mL。由于1 ng/mL氧化乐果的响应较低， 其 LOQ 提高到了5 ng/mL。其他 32种农残的 LOQ均达到1ng/mL。表 8 中 LOQ 低于 1 ng/mL 的农残已用“*”标出。表8列出了辣椒基质中农残的定量结果和良好的线性结果。与橙子结果相同， DDT 的 RSD 接近 15%，这个问题在分析很多样品时都存在。其他的农残都获得了良好的系统重复性。 图6. 辣椒基基空白和1 ng/mL 农残辣椒基质加标液的 GC/QQQ MRM 色谱图。峰识别请参照表3。由于低响应，在辣椒基质中未能识别出1 ng/mL 的氧化乐果(6) 表8. 定量结果(辣椒基质) 10 ng/mL 农残的辣椒基质加标溶液10次进样的RSD(%) *使用当前方法，可获得更更 LOQ的农残 菠菜中农残的痕量分析 由于其基质的复杂性和反复性的基质抑制效应，菠菜是众所周知的富于挑战性的食品基质。图7所示为菠菜基质空白和1ng/mL农残菠菜基质加标液的 GC/QQQ MRM 色谱图。基质效应使1ng/mL的甲胺磷、敌敌畏、乙酰甲彤磷、氧化乐果、甲萘威和溴氰菊酯响应降低，并使它们的峰形也发生变化。因此，菠菜中这些农残的LOQ 为 5 ng/mL。由于背景干扰，林丹丰度最高的 MRM 跃迁(180.8>145)无法用于定量。因此选择丰度稍低的MRM 跃迁(218.8>183)用于定量。菠菜中，超过半数的农残(表9中已用 6f￥95'，标出)LOQ 低于 1 ng/mL。表9列出了定量结果和良好的线性结果。大多数农残 10 ng/mL QC 样品 10次重复进样的 RSD均小于15%。DDT、氧化乐果、硫丹硫酸酯和异狄氏剂酮的 RSD略高于 15%。此外，乙酰甲胺磷、甲萘威、亚胺硫磷和异菌脲的响应表现出轻微的降低趋势。因此，在进行多组分分析的时候，有必要增加更换衬管的频率。苯氟磺胺和甲苯氟磺胺为碱性标记化合物，他们在菠菜萃取液中的不稳定性导致了其 RSD 值要高于在其他基基中的 RSD值。 计数 vs 采集时间(min) 图7. 菠菜基质空白和1 ng/mL 农残菠菜基质加标液的 GC/QQQ MRM 色谱图。峰识别请参照表3。由于低响应或者基质干扰，在菠菜基质中未能识别出1 ng/mL的甲胺磷(1)、敌敌畏(2)、乙酰甲胺磷(4)、氧化乐果(6)、甲萘威(14)和溴氰菊酯(33) 表9. 定量结果(菠菜基质) 10 ng/mL 农残的菠菜基质加标溶液10次进样的 RSD (%) *使用当前方法，可获得更低 LOQ的农残 结论利用 GC/MS或者 GC/MS/MS进行食品基中中的多农残分析一直是一项具有挑战性的工作。不同基质对不同的分析物质，尤其像氧化乐果、DDT和乙酰甲胺磷这样的活性物质表现出的影响也不尽相同。基质会干扰定量结果，降低响应(导致高定量限)和/或扭曲峰形。因此，采用基质匹配的校准曲线对获得准确而可靠的定量结果至关重要。图8所示为不同基质10次进样的重复性结果(响应系数%RSD)比较。反吹和安捷伦超高惰性玻璃棉衬管可有效保护整个系统， 改善系统的耐受性。而对于复杂难分析的食品基质如菠菜，在进行多组分残留分析时，需要对活性物质如氧化乐果和 DDT 在峰形和重复性上给予更多的关注。此报告使用 GC/QQQ 对6种不同种植作物基质中的33种代表性农残组分进行了测定，结果表明，对于大多数农残来说，定量限(LOQ)可达1 ng/mL甚至更低， 从 LOQ 到 100 ppb间的线性良好， 10 ng/mL 农残基质加标液的重复性结果令人满意。而在某些基质中，甲胺磷、氧化乐果、甲萘威和溴氰菊酯的 LOQ 无法达到 1 ng/mL。在报告所涉及的所有食品基质中，大多数农残均表现出了卓越的线性(R2>0.99)和重复性(%RSD<15%)。 ( 参考文献 ) ( 1.D M. 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