蔬菜中有机磷农药残留检测方案(液质联用仪)

南京农业大学学报2012，35(1)：45-50Journal of Nanjing AgriculturalUniversityhttp：//nauxb. njau. edu. cn 南 京 农 业 大 学 学 报第35卷46 王雯，梁颖，沈燕，等.液相色谱-串联质谱法检测黄瓜中5种有机磷农药残留[J].南京农业大学学报，2012，35(1)：45-50 液相色谱-串联质谱法检测黄瓜中5种有机磷农药残留 王雯12，梁颖1.3，沈燕1.3，马尧瑶'，钱建亚”，刘贤进1，3* (1.江苏省食品质量安全重点实验室，室苏南京210014；2.扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州225009；3.农业部食品安全监控重点开放实验室，江苏南京210014) 摘要：建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)同时检测黄瓜中敌百虫、乐果、敌敌畏、杀螟硫磷、毒死蜱5种有机磷农药残留的方法。样品经过丙酮提取，弗罗里罗土净化，以甲醇-水(水相含0.1%甲酸)为流动相梯度洗脱，采用 ZORBAX SB-C(5 p.mx2.1 mmx150 mm)色谱柱分离，电喷雾离子化正模式(ESI*)离子化，多反应监测模式(MRM)下测定。结果显示：方法标准曲线线性良好，R≥0.998；乐果与敌敌畏的定量限为0.002 mgkg，敌百虫、杀螟硫磷和毒死蜱的定量限为 0.01mg·kg；回收率为72%~98%，相对标准偏差(RSD)≤3.6%。表明：该方法可实现对5种有机磷农药的同时快速测定，目标农药的响应值高，检测限低，能够为生食蔬菜风险评估研究提供准确有效的数据支持。 关键词：液相色谱-串联质谱；有机磷农药；黄瓜；检测 中图分类号：S481*.8 文献标志码：A 文章编号：1000-2030(2012)01-0045-06 Simultaneous determination of five organophosphoruspesticide residues in cucumber by LC-MS/MS WANG Wen，LIANG Ying，SHEN Yan，MA Yao-yao'， QIAN Jian-ya’，LIU Xian-jin 3* (1. Key Laboratory of Food Quality and Safety，Jiangsu Province，Nanjing 210014 ，China；2 College of Food Scienceand Engineering， Yangzhou University， Yangzhou 225009，China；3. Key Laboratory of Food SafetyMonitoring and Management，Ministry of Agriculture，Nanjing 210014，China) Abstract： A method to identify and quantify five organophosphorus pesticides about trichlorfon， dimethoate， dichlorvos， fenitrothionand chlorpyrifos in cucumber was developed using the liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometric (LC-MS/MS). The sample was extracted by acetone and cleaned up with florisil. The separation was performed on a ZORBAX SB-Cg(5 pmx2.1 mmx150 mm) with the gradient elution of methanol-water with 0.1% formic acid (volume ratio) as mobile phase. Sample wasdetected by multiple reaction monitoring (MRM) with electric spray ionization(positive). The result showed that satisfactory linearresults have been got with R’≥0.998. The limit of quantity (LOQ) of dimethoate and dichlorvos was 0.002 mg·kg，and the limit ofquantitaty(LOQ) of trichlorfon，fenitrothin and chlorpyrifos was 0.01 mgkg，depending on the matrices and spiked concentration，ranging from 72% to 98% with relative standard deviations(RSD)≤3.6%.This simple， rapid and sensitive method can be appliedto supplying reliable data for the study of the risk assessment of raw vegetables. Key words： liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometric (LC-MS/MS)； organophosphorus pesticide；cucumber；determination 有机磷农药是一种常见的胆酰酯酶抑制剂，作为杀虫剂和杀螨剂在大部分作物中使用。2008和2009年绿色和平组织对京沪穗三市多家大型超市的水果蔬菜抽检显示，黄瓜是农药残留量排名第一位的蔬菜，共含有4~13种不同农药残留。黄瓜作为一种重要的生食蔬菜，其农药残留问题受到人们更为广泛的关注21。因此建立一种样品前处理简便、快速，能排除基质干扰，且定量准确的多残留测定方法具有重要的实际意义3] 目前国内外关于有机磷农药多残留检测的方法有很多。大多数采用带有质谱、氢火焰离子检测器(FPD)和氮磷检测器(NPD)的气相色谱法分析蔬菜水果中的有机磷农药残留[4]。液质联用技术作为一种新型的现代仪器分析手段，因其高灵敏性，高准确性，高选择性，分析检测范围宽，时间短以及其定性、定量方面的强大功能等特点，在食品分析检测领域得到了广泛的应用[51。液质联用技术已经成为分析水果 ( 收稿日期：2011- 0 3-24 ) ( 基金项目：江苏省自主创新资金项目(c x (09)101，cx(09)632) ) ( 作者简介：王雯，硕 士 ，研究方向为食品安全，E-mail：q u iliyun@126. com。*通讯作 者 ：刘贤进，研究员，E-ma i l： j a a sliu@ jaas. ac. c n 。 ) 蔬菜中农药残留的有效工具[4]。刘宝峰等16]建立了一种用高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定蔬菜水果中65种农药残留的方法。但基本不涉及有机磷类农药。潘见等7采用高效液相色谱-串联质谱法，建立了华东地区叶菜中常用的有机磷类农药多残留的快速定量检测方法。Chung 等8建立了一种基于液相色谱-串联质谱同时检测蔬菜水果中98种有机磷和氨基甲酸酯的快速处理方法。可见，液质联用已经逐渐代替气相色谱(气质联用)成为检测有机磷农药的有效手段。 本文选取了有机磷农药中广泛使用且具有代表性的5种农药，以黄瓜为基质，建立液质联用检测农药多残留方法，为食物中微量有机磷农药风险评估研究打好基础。 材料与方法 1.1 供试农药标准品 敌百虫(trichlorfon)、乐果(dimethoate)、敌敌畏( dichlorvos)、杀螟硫磷(fenitrothion)、毒死蜱(chlorpyrifos)均购自农业部环境保护科研检测所，纯度均≥98%。 1.2 试剂 丙酮：分析纯，上海中式化工总公司产品；正己烷：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司产品；乙腈：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司产品；氯化钠：分析纯，西陇化工股份有限公司产品；无水硫酸钠：分析纯，西陇化工股份有限公司产品；产醇：色谱纯，德国 Merck 公司产品。 1.3 仪器 Meyer-N-Evap Model 111 氮吹仪(美国 Organomation Associates 公司)；ULTRA-TURRAX T18 Basic 高速组织捣碎机(德国 IKA 公司)；ULTRASONIC CLEANER 超声波清洗器(南京先欧仪器制造有限公司)；WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；ZD系列落地摇床(太仓市科教器材厂)；SCAA-104滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)；JJ系列电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；弗罗里硅土小柱(自制)。 Agilent 1200 Series 液相色谱仪； Agilent 6410 三重串联四极杆质谱仪，配置 G1948B 电喷雾离子源(ESI)；Agilent 色谱柱：ZORBAX SB-Cg(5 pmx2.1 mmx150 mm)、ZORBAX SB-Cjg(5 pmx2.1mm×30 mm)、ZORBAX SB-Aq Narrow-Bore Guard Column(2.1 mmx12.5 mm，5 um)。 1.4 标准溶液的配制 用甲醇作溶剂，配制 100 mg·kg-'混合标准储备液，避光保存于4℃冰箱中，使用时逐级稀释成质量量度分别为10、50、100、200、500、1000和2000 ngmL"的系列混合标准工作溶液。 1.5 LC-MS/MS 分析条件 1.5.1 MS/MS 条件的建立 对5种目标农药的标准品进行质谱扫描，确定其母离子。对毛细管出口电压(fragmentor)、碰撞气能量(collision energy)、干燥气温度、干燥气流速、离子源温度进行优化，确定其特征离子，选择相对强度大、信号稳定的碎片离子作为检测离子。 1.5.2 HPLC 条件的建立 Agilent ZORBAX SB-C(5 pmx2.1 mmx150 mm)，流动相选择甲醇、乙乙和水，比较甲醇-水和乙腈-水两种流动相配比对结果的影响。在水相中加入0.1%的甲酸(体积分数)，比较适量甲酸对结果的影响。在已建立的质谱条件下改变流动相的配比和流速优化目标农药分离的线性梯度洗脱程序110]。 1.6 样品提取与净化 1.6.1 提取 试验比较丙酮和乙腈这两种种剂剂提取效果。准确称取2组20.00g黄瓜(购于当地超市)样品于锥形瓶中(每组有若干重复)，准确加确40 mL 提取溶剂(丙酮或乙腈)，匀浆1 min，摇床振荡30 min；将样品过滤，加入过量 NaCl，振荡后静置5 min；取上层清液10 mL，氮吹至近干。。一组用色谱甲醇定容至1 mL，过0.2 p.m 有机系微孔滤膜，供 LC-MS/MS测定；另一组用1 mL丙酮与正己烷混合液(体积比为1：1)溶解残留物，待净化。 1.6.2 净化米将黄瓜提取液分为2份，采用 SPE 填充柱，填料依次为为罗里硅土0.7g、石墨墨碳0.1g、无水硫酸钠1 g，依次用5 mL 正己烷、5 mL丙酮与正己烷(体积比1：1)预淋洗，当液面到达柱顶部时，将样品溶液转移到小柱上，一份用10 mL 丙酮与正己烷(体积比8：2)分次洗脱(过程中洗涤样液瓶)，另一份用10 mL丙酮与正己烷(体积比1：1)分次洗脱(过程中洗涤样液瓶)，收集洗脱溶液，氮吹至近干，用甲醇定容至1mL，过0.2 u.m有机系微孔滤膜，供 LC-MS/MS 测定。 2 结果与讨论 2.1 质谱条件的优化 为了消除复杂基质对检测器灵敏度的影响，采用串联质谱(MS/MS)的多反应监测(MRM)技技，目标物经过液相色谱柱分离后，经过一级质谱对相对分子质量进行筛选，电离后经过二级质谱对离子进行筛选，这样，提高了被分析物的信噪比，从而去除共流出物的干扰，最大限度地排除杂质背景，显著提高实际样品的灵敏度和定量分析的准确性。详细质谱条件见表1。 表1 5种有机磷农药的质谱条件 Table 1 The mass spectrometric operating conditions for detecting five organophosphorus pesticides 农药 母离子/(mz) 子离子/(mz) 毛细管出口电压/V 碰撞气能量/eV Pesticides Parention Production Fragmentor Collision energy 敌百虫 Trichlorfon 257.1 221.0 110 4 127.0 7 109.0° 10 乐果 Dimethoate 230.2 199.0* 90 5 171.0 9 敌敌畏 Dichlorvos 221.2 145.1 135 5 109.1* 10 杀螟硫磷 Fenitrothion 278.1 246.1 135 10 125.1 20 109.1 20 毒死蜱 Chlorpyrifos 350.1 198.0 110 15 97.1* 30 注：*定量离子 Quantification ion 试验结果表明，干燥气温度与流速对峰形有较大影响。随着干燥气温度与流速的增加，色谱峰变得尖锐。因为温度与流速增加，液滴雾化充分，溶剂去除彻底，有利于分子破碎为离子，从而提高了检测的灵敏度。当干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L·min时，色谱峰分离效果和峰形最佳。 2.2色谱条件的建立 流动相的组成对 LC-MS/MS 测定的信号强度会产生很大影响，本文选用甲醇、乙腈、水体系作为流动相考察对目标农药色谱行为的影响。结果表明，乙腈作为流动相对多种目标农药的分离情况不如甲醇，并且峰形不理想。因此本文采用甲醇作为流动相，并考察了甲醇与水配比对分离效果的影响。结果表明，随着水含量的增加，分析时间变长，峰形变宽，出现严重的拖尾现象，且灵敏度降低；而水含量减少时，峰形变窄，对称性良好，但灵敏度降低。为此本试验在每种农药最佳流动相配比的基础上在水相中加入甲酸采用梯度洗脱并且优化洗脱条件(梯度洗脱程序见表2)，结果显示目标农药在10 min内全部出峰，且目标农药达到较高的检测灵敏度。表明，水相中加入0.1%的甲酸(体积分数)后，色谱峰的峰形较之前对 表25种有机磷类农药色谱分离的线性梯度洗脱程序 Table 2 The linear gradient elution program of separatingfive organophosphorus pesticides 时间/min 流动相*/% 流速/(mL·min-) 最大压力/bar Time Mobile phrase Flow Maximum pressure 0.0 56 0.2 2.0 56 0.2 2.1 90 0.4 3.0 90 0.4 4，0 65 0.3 4.1 90 0.3 6.0 90 0.3 600 7.0 75 0.3 7.1 75 0.4 8.0 56 0.3 8.5 56 0.3 12.0 56 0.3 12.5 0.2 注：*流动相中甲醇的含量 The concentration of methyl alcoholin mobile phrase 称尖锐，从而降低了仪器的检出限。所以本试验采用甲醇-水(含0.1%甲酸，体积分数)作为流动相。 通过对目标农药质谱条件的优化，以及改变不同时间段的流动相配比和流速，达到短时间内检测出目标农药的目的，同时保证其较高响应值。 2.3 样品前处理条件的优化 2.3.1 提取方式的选择 考虑以下几个因素：1)黄瓜水分含量很大，宜采用与水相混溶的溶剂进行提取；2)选取的几种目标农药极性差别较大，宜采用覆盖面宽的溶剂提取。综上，试验选用乙腈与丙酮作为提取剂进行比较。表3列出了添加水平为0.05 mgkg时各种处理方式下5种农药的回收率及相对标准 偏差。根据分析结果，用乙腈提取目标农药的回收率低于丙酮，究其原因，可能由于乙腈极性较丙酮大，导致黄瓜提取液中的杂质较多，影响了仪器的灵敏度，使目标农药的回收率偏低。因此，采用丙酮作为提取剂进行后续试验。 2.3.2 净化方式的选择 由表3可见，未经净化的样品中目标农药的回收率较低，可能由于黄瓜基质中杂质干扰，样品需经过进一步的净化操作。试验选用弗罗里硅土作填料，体积比分别为1：1和8：2的丙酮与正己烷作为洗脱液对提取液进行净化。分析结果显示，洗脱液体积比为1：1的丙酮与正己烷对个别农药的洗脱能力较弱，导致个别农药的回收率偏低。而采用体积比为8：2的丙酮与正己烷作为洗脱液时，对每种目标农药均有较好的洗脱效果。 本试验选用较常见的多残留提取溶剂乙腈和丙酮，将丙酮与正己烷按不同比例混合改变洗脱剂的极性，保证不同极性的目标农药最大程度地提取和洗脱下来，达到同时检测出极性差异较大的多种农药的目的。 表3 样品前处理条件优化结果 Table 3 The optimizing result of preliminary treatment conditions of samples 农药 处理 添加0.05 mg·kg- Spiked 0.05 mg·kg Pesticides Treatment 乙乙 Acetonitrile 丙酮 Acetone 回收率/% Recovery RSD/% 回收率/% Recovery RSD/% 未净化 No purification 38.4 3.1 50.3 4.2 丙酮：正己烷(1：1) 敌百虫Trichlorfon净化 Acetone ：hexane(1：1) Purification 丙寸：正己烷(8：2) Acetone ：hexane(8：2) 未净化 No purification 43.7 69.4 3.7 87.8 2.4 6.1 62.5 4.3 丙酮：正己烷(1：1) 乐果Acetone ：hexane(1：1) Dimethoate 净化 Purification 丙酮：正己烷(8：2) Acetone ：hexane(8：2) 未净化No purification 46.2 77.2 2.6 84.7 1.7 2.4 50.3 3.6 敌敌畏 净化 丙酮：正己烷(1：1) Acetone ：hexane(1：1) 69.4 4.6 Dichlorvos Purification 丙酮：正己烷(8：2) Acetone：hexane(8：2) 85.0 2.3 未净化 No purification 47.1 2.6 43.5 3.6 杀螟硫磷 净化 丙酮：正己烷(1：1) Acetone ：hexane(1：1) 69.8 2.2 Fenitrothion Purification 丙酮：正己烷(8：2) Acetone ：hexane(8：2) 81.6 2.7 未净化 No purification 45.1 4.6 58.6 2.3 毒死蜱 净化 丙酮：正己烷(1：1) Acetone：hexane(1：1) 82.4 3.6 Chlorpyrifos Purification 丙酮：正己烷(8：2) Acetone ：hexane(8：2) 85.9 2.3 2.4 方法的线性相关性 本试验采用阴性黄瓜提取液配制系列标样，分别配制10、50、100、200、500、1000和2000 ngmL-的系列混合基质标准工作溶液，在上述液相色谱-质谱条件下进行相同体积的进样，进样量为10 pL，以进样浓度为横坐标、响应值为纵坐标建立标准曲线。由表4可见，方法线性相关性良好，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液的响应值均在仪器测定的线性范围内，符合农药残留分析方法的要求。 2.5 方法的回收率及精密度 在阴性黄瓜中添加5种有机磷标准溶液，添加水 表4 5 种有机磷农药的标准曲线回归方程和绝对系数 Table 4 The respective regression equation，absolutecoefficient of the standard curve of fiveorganophosphorus pesticides 农药 线性方程 绝对系数(R) Pesticides Linear equation Absolute coefficient 敌百虫 Trichlorfon Y=48.000X+518.116 0.999 乐果 Dimethoate Y=104.918X+1 713.752 0.998 敌敌畏 Dichloryos Y=169.070X+873.277 0.999 杀螟硫磷Fenitrothion Y=12.525X+39.248 0.999 毒死蜱 Chlorpyifos Y=30.580X+80.666 0.999 注：Y：峰面积 Peak area；X：质量浓度(ngmL-)Mass concentration 平为0.01、0.05和0.10 mg·kg，每个添加水平平行测定3次，按上述方法处理样品后，检测其农药的残留量。表5结果显示，添加0.01 mg·kg-目标农药的回收率为72.3%~81.8%，相对标准偏差(RSD)≤3.6%。目标农药添加回收的总离子流图见图1。 表5 5种有机磷农药的添加回收率和相对标准偏差(RSD)(n=3) Table 5 Recoveries and precisions(RSD) of five organophosphorus pesticides under different spiked levels 添加水平/(mg·kg-) Spiked levels 农药 0.01 0.05 0.10 Pesticides 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% Recovery Recovery Recovery 敌百虫 Trichlorfon 74.2 3.6 87.8 2.4 80.2 1.5 乐果Dimethoate 72.3 3.2 84.7 1.7 97.5 1.0 敌敌畏 Dichlorvos 74.5 3.5 85.0 2.3 98.0 1.2 杀螟硫磷Fenitrothion 72.3 1.7 81.6 2.7 86.5 1.2 毒死蜱 Chlorpyifos 81.8 1.4 85.9 2.3 88.6 2.9 +ESI TIC MRM Frag=110.0 V CID@(257.1->")201010... 图1 空白黄瓜以及添加5种有机磷农药(0.01mg·kg)的总离子色谱图 Fig.1Total ion current chromatograms of cucumber blank spiked with five organophosphoruspesticides(0.01 mgkg)and blank control 目标峰Peaks：1.敌百虫 Trichlorfon；2.乐果 Dimethoate；3. 敌敌畏 Dichlorvos；4.杀螟硫磷 Fenitrothion；5.毒死蜱 Chlorpyifos；6.空白对照 Blank control 2.6 方法的检出限及定量限 在优化色谱-质谱条件下，为研究方法的检出限与定量限，试验设计了添加水平为 0.002 mg·kg的5种农药的总离子流色谱图(略)。由定性定量信噪比可以看出，当添加浓度为 0.01 mg·kg-时，5种农药的信噪比均大于10，添加浓度为 0.002 mg*kg-'时，乐果与敌敌畏这两种农药的信噪比大于10，所以可将乐果与敌敌畏的定量限(LOQ)定为0.002 mg·kg'，敌百虫、杀螟硫磷和毒死蜱受杂质影响，信噪比低于10，所以将敌百虫、杀螟硫磷和毒死蜱的 LOQ定为 0.01 mgkg。方法的限出限与定量限均满足国内外农药残留的要求。与相关文献相比，本试验在检测灵敏度与分析速度上均有一定的提高[6，11-13]。 3 结论 随着设施农业的大力发展，农药残留的潜在风险也慢慢扩大，我国的黄瓜年产量大，黄瓜大棚种植方式占47%，这样大大提高了黄瓜农药残留的风险。因此，研究黄瓜中农药残留的快速检测方法势在必行。本研究建立了黄瓜中敌百虫、乐果、敌敌畏、杀螟硫磷、毒死蜱这5种有机磷农药的检测方法，其中乐果与 敌敌畏的定量限为0.002 mgkg，敌百虫、杀螟硫磷和毒死蜱的定量限为0.01 mgkg，回收率在72%~98%范围内，RSD≤3.6%。该方法能够使这5种有机磷农药在10 min 内全部出峰，且检测限低，能够为生食蔬菜风险评估的研究提供准确有效的数据支持。 ( 参考文献： ) ( ] 江英 志， 谢 桂勉.有机磷农药多残留检测研究进展 [J ] . 安徽农业科学 ， 2010，3 8( 17)：9060-9061，9192 ) ( 发 现者.中国农残 检 测为何形同虚设 [ EB/OL ] .[ 2 010-12 - 19]. http：//news.163. com/special/pesticideresidue/ ) ( 张晓荣，段敏.农产品中农药残留检测技术研 究 进展[J].陕西农业科学，2009(2)：114-117 ) ( M ol H G J，van Dam R C J ，St ei jger O M. 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