化妆品中激素检测方案(液质联用仪)

·外示 液相色谱-串联质谱法测定化妆品中多种激素 武中平，卢剑，高 巍，俞幼芬 (国家化妆品质量监督检验中心，江苏南京 210029) 摘要：采用液相色谱-串联质谱法测定化妆品中糖皮质激素、雌激素、雄激素、孕激素等激素的含量。不同形态的化妆品样品以甲醇为提取剂进行超声提取，样品提取液离心后得到上清液经 HLB固相萃取小柱净化，用 Agilent ZORBAXEclip se XDB-Cis柱(1. 8pm，2. 1 mm X50 mm)，乙腈-水作为流动相，梯度洗脱，流速 0.3mL/m in，柱主 25℃，进样量210pL，糖皮质激素、雄激素、孕激素采用正离子扫描模式，雌激素采用负离子扫描模式，多反应监测测定。化妆品样品平均加标回收率为72.31%~97.89%，相对标准偏差为224%~11.34%，方法检出限为0. 002 mg/kg~0.8 mg/kg. 关键词：化妆品；激素；测定；液相色谱-串联质谱法 中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：1001-1803(2010)02-0153-04 Determ ination of various hormones in cosmetics byliquid chroma tography together with mass spectrom etry WU Zhong-ping，LU Jian， GAO W ei， YU You- fen (National Suspecting and Testing Center for Cosmetics，Nanjing， Jiangsu 210029， China) Abstract： Content of various kinds of homones，：， including glucocorticoids， oestrogens， androgens andprogestogen in cosmetics were detemm ined by liquid chromatography together with mass spectrometry Variouscosmetics samples were extracted by methyl alcohol under help of ultrasonic waveTThe extracts werecentrifuged， and the upper clear solutions were purified by HLB SPE columns and separated with AgilentZORBAX Eclipse XDB- Ci8 column (1. 8ym， 2. 1 mm ×50mm)， using a mobile phase consist ofaceton itrile- water and gradient eluted at a flow rate of 0.3 mL /m in The column temperature was 25℃ andthe injection volume was 210pL. Glucocorticoids， androgens and progestogen were analyzed in the positive ionscann ing mode， while oestrogens were analyzed in the negative ion scanning mode The detections were madewith MRM mode The average recoveries achieve between 72. 31% and 97. 89%， and the relative standarddeviations(RSD) achieve between 2 24% and 11. 34%.The detection lim its of this method achieves0.002 mg/kg~0.8 mg/kg Key wods： cosmetics， homones detem ination； liquid chromatography together with mass spectrometry 化妆品与人们的生活密切相关，近几年随着我国人民生活水平的提高，化妆品已成为必不可少的消费品之一。与此同时，化妆品的安全性已经日益成为广大消费者关注的问题。化妆品中所添加的某些化学物质对人体健康具有潜在的危害。 短时间使用含有糖皮质激素的化妆品可使皮肤光滑细腻、红闰白嫩。但长期使用易导致皮肤变薄、发红、发痒，另外通过皮肤吸收可引起全身副作用，导到面部皮肤损害、骨质疏松、肌肉萎缩、生长发育迟缓、免 疫功能下降、诱发或加重感染和消化性溃疡、情绪异常、代谢紊乱等各种不良反应。一旦停用，皮肤就会发红、发痒，出现红斑、丘疹、脱屑等。由于性激素的重要生理功能，化妆品中添加性激素能够在短时间内促毛发生长，防止皮肤老化，除皱、增加皮肤弹性或治疗粉刺等。但长久使用会导致色素沉积、产生黑斑、皮肤萎缩变薄，甚至具有致癌性。 我国《化妆品卫生规范》和欧盟化妆品规程(D irective 76/768/EEC)中均明确规定，不得使用含 ( 收稿日期：2009-09-16；修回日期：2 0 09-12-2 1 ) ( 基金项目：国 家 质量技 术 监 督检 验检 疫 总 局资 助项目(200 7 QK131)；江 苏省质 量技 术监 督局资助项目(K J0 83102) ) ( 作者简介：武中平(1974-)湖人 . 程 人 . 十. 电话： (025 ) 86536608. ) 有雌激素、雄激素、孕激素和糖皮质激素的物质作为化妆品原料。因此，检测各种化妆品中是否含有雌激素、雄激素、孕激素和糖皮质激素，对于控制化妆品的产品质量，确保化妆品的使用安全，保障人民身体健康具有重要的意义。 通过对样品前处理技术、色谱和质谱操作条件等方面进行研究，建立了一种可测定化妆品中多种激素(包括雌激素、雄激素、孕激素和糖皮质激素)含量的液相色谱-串联质谱法。 实验部分 1.1仪器与试剂 Agilent 1200/6410液相色谱-串联质谱仪，美国Agilent公司；N-EVAP12氮吹仪，美国 OrganomationA ssociates公司； Waters Oasis HLB 固相萃取小柱，美国W a te rs公司；SB- 800DT超声波清洗机，宁波新艺生物科技有限公司；XHC旋涡混合器，江苏省金坛市医疗仪器厂；AvantiJ-E高速离心机，美国贝克曼库有限公司； Supelco cm -12固相萃取装置，美国 Supel2co公司。 乙晴、甲醇，均为色谱纯；电阻率为18.2m2· cm超纯水；曲安奈德，质量分数≥97.0%；地塞米松、雌二醇，质量分数≥97.5%；泼尼松、醋酸泼尼松龙、丙酸倍氯米松、睾丸酮、醋酸可的松、甲基睾丸酮、醋酸地塞米松、雌酮、己烯雌酚、丙酸氯倍他索、雌三醇、醋酸氢化可的松，质量分数 ≥99.0%；氢化可的松、泼尼松龙、倍 1.225实验方法 1.21溶液的配制 使用前分别准确称取适量激素标准品，用乙腈分别配制成质量浓度为 100 儿g /mL的标准储备液。据需要再用乙腈逐级稀释成不同质量浓度的系列混合标准工作溶液。 1.22样品前处理 准确称取化妆品试样0.5g(确至0.02g)于50.0mL聚四氟乙烯离心管中，移入20. 0 mL 甲醇-3]，超声提取20. 0 min， 以 14 000 r/m in 离心10.0m in，准确移取上清液 10.0mL于刻度试管中，在50℃水浴中用氮气吹至近干，加入p(CH，OH)=20%水溶液，定容至20mL，在旋涡混合器上混合2.0min，待净化。 用5.0 mL甲醇活化 Waters Oasis HLB 固相萃取小柱2-3后后，再用5.0mL水平衡，当溶剂液面到达小 柱吸附层表面时，将待净化液加入固相萃取小柱，先用4.0mL水淋洗，再用6.0mL甲醇洗脱，使液滴逐滴流下。收集洗脱液，在50℃水浴中用氮气吹至近干，加入乙腈，定容至2.0mL。在旋涡混合器上混合2. 0min，过0.2m微孔滤膜，待测。 1.233色谱操作条件 液相色谱柱： A gilent ZORBAX Ec lip se XDB-C(50 mm ×2 1 mm， 1. 8pm)；流动相：乙腈-水，梯度洗脱；流速：0.3mL/m in；柱温：25℃；进样量：20pL。 1.244质谱条件 电喷雾离子源；毛细管电压 4.0 kV；喷雾器压力2.8959×10° Pa；干燥器流速 10 L /min；干燥器温度：350℃；多反应监测 (MRM)模式。 2结果与讨论 2.1 样品前处理 化妆品样品含有一定量的油脂、蜡质，在用溶剂残留于这些样品中的激素进行提取时不可避免地会将油脂、蜡质等物质也提取出来，从而对检验结果造成干扰，并影响分析仪器的性能、寿命。作者通过实验发现，乙腈和甲醇均可作为化妆品样品激素残留测定的提取溶剂，但乙腈和甲醇相比，价格贵一些，且浓缩时间长，并且由于其极性较强，对化妆品中其他极性物物也有较强的提取能力，从而增加了后面净化过程的难度。故采用甲醇做提取剂对化妆品中多种激素残留行提取，得甲醇提取液。用 Waters Oasis HLB固相萃取小柱对提取液进行净化，结果表明，该净化技术能很好地除去样品中油脂、蜡质以及一些极性物质对检验仪器、分析结果的干扰、影响。 2.2流动相及洗脱条件的优选 在色谱柱上，分别考察了乙腈-水、甲醇-水、腈-10 mmol/L 乙酸铵水溶液、甲醇-10mmol/L乙酸铵水溶液等流动相体系对多种激素的分离效果，结果表明，采用乙腈-水流动相体系梯度洗脱有利于多利激素的分离。为了改善泼尼松龙、泼尼松和氢化可的松的分离，同时使雌三醇的保留时间适当延长，乙腈起始比例不能太高，经过实验，最终确定了如下梯度洗条件：0~10.0min乙体体积分数(下司)由18%线性增加到38%；10.0m in ~12. 0 m in乙由38%线性增加到 48%；12 0m in~14. 0 m in 乙腈由 48%线性增加到 68%；14.0min~16.0 min 乙腈由68%线性增加到95%，保持 1.0 m in； 17. 0 min~17.5 min乙腈由95%线性降低到 18%，保持25m in。 2.3质谱条件的选择 ESI+和 ESI-作为离子化模式进行质谱条件的优化。分析条件参数见表1。 根据待检激素化合物的化学电离性质，分别选用 表1多种激素的质谱分析参数 Tab 1 Analysis results of 19 kinds of homones by liqu id chromatography toge ther with mass spectrometry 在正离子和负离子模式下分别进行全扫描以选择适当的电离方式和分子离子峰。实验结果表明，糖皮质激素、雄激素和孕激素在离子源 ESI+电离方式下，可获得较高丰度的 [M+H]*母离子，雌激素在离子源ESI-电离方式下，可获得较高丰度的[M-H]-(3-4)。在确定各激素的母离子后，采用子离子扫描方式对子 离子进行了优化选择，确定了定量离子和辅助定性离子。通过优化毛细管电压、去溶剂气温度、去溶剂气济量、碰撞气压力、碎裂电压、碰撞能量及质谱分辨率等质谱参数，使待检激素的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。多种激素的总离子流图见图1。 图11多种激素的总离子流图 Fig1ITK of various hommones 2.41线性方程和方法检出限以及方法的精密度和回收率 用配制好的标准溶液(0. 05 mg/L， 0. 1 mg/L，0.2mg/L， 0. 5 mg/L， 1. 0 mg/L 和 2.0mg/L)按照1.22条件进行测定，用质量浓度-峰面积计算其线性方程和相关系数，以3倍信噪比确定各激素的检出限。数据见表2。对空白化妆品添加不同浓度标准溶液进行添加回收率和精密度实验。添加3个水平，每个添加水平重复6次，分别计算平均添加回收率和相对标准偏差。其数据也列于表2。 表2：线性方程、检出限、平均添加回收率和相对标准偏差 Tab 2 Regression equation，R， lim it of detection， recovery and RSD 序号 名称 线性方程 R’ LOD 平均加标 RSD /mg.kg 回收率/% /% 1 雌三醇 y=2167 3x-103. 86 Q 9947 Q8 77.22 934 2 泼尼松龙 y=43 314x+49192 9842 0002 7665 443 3 泼尼松 y=10 738x+1247.1 09936 0008 7665 3.02 4 氢化可的松 =7482 9x+833 24 09953 001 9414 396 5 倍他米松 v=15 331x+2 211. 3 Q9937 0005 7231 3.59 6 地塞米松 y=16 352x+2041 3 09931 0005 79 39 398 7 曲安奈德 y=88836x+19866 09943 0005 8958 4 92 8 醋酸泼尼松龙醋 y=12 262x+1905 3 09921 0005 8048 266 9 酸氢化可的松雌 y=11 183x+631. 13 09916 001 93.53 3.36 10 二醇醋酸可的松 v=61060x+16418 09979 03 8638 11.34 11 睾丸酮甲基 v=8 098 8x+318 26 09968 0015 81.06 317 12 睾丸酮 y=8 077 9x+2469 7 0991 9 004 89.60 432 13 醋酸地塞米松 y=15 764x+2190 1 09987 004 77.73 2 57 14 雌酮己烯 y=55048x+615 85 09908 0012 73.01 243 15 雌酚 v=6 200.0x-348 97 Q9951 032 9495 474 16 孕酮丙酸氯倍 v=10 869x-29623 09998 0008 97.89 224 17 他索 y=7 577 4x+653. 67 09949 0007 9091 7.00 18 v=1 239 0x+442 60 09947 014 7656 1011 19 .丙酸倍氯米松 y=1 441 1x+11649 0995 1 0.11 79 95 10 15 3结语 建立的对化妆品中雌激素、雄激素、孕激素和糖皮质激素等残留量的液相色谱-串联质谱测定方法，前处理简单，操作方便，线性范围较宽，检出限低(0.002 mg/kg~0. 8 mg/kg)，精密度和准确度好(加标平均回收率为7231%~97.89%，相对标准偏差为2.24%~11.34%)，符合实验室对化学污染物残留澳定方法的要求，可应用于化妆品样品中上述激素残留量的测定。 ( 参考文献： ) ( [1] 马强 ， 王 超，王 星，等 .超高效液相色 谱 法同 时 测 定 化妆品中的 1 5 种激素[J].色谱，2007，25(4)：541-545. ) ( [2] 王超， 马强，王 星 .反相高效液相 色谱 法 同 时 测 定 化妆品中1 6种 激 素 [J].色 谱 ， 2 0 0 6，24(6)：654-655. ) ( [3] 王 超 ， 马 强， 王 星，等 .液相 色谱-串联 质谱 法 同 时 测定化妆品中的 16 种激素[J ] 分析化学，2007，35( 9 )：12 5 7-1262 ) ( [4]陈 慧 华，应永 飞，吴平谷 ， 等 . 液 相 色 谱-串 联 质 谱同 时 测 定 动物 组织中22种同化激素 [ J]. 分 析化 学 ， 20 0 9， 37(2)：181-18 6 . ) ： 采用液相色谱－串联质谱法测定化妆品中糖皮质激素、雌激素、雄激素、孕激素等激素的含量。不同形态的化妆品样品以甲醇为提取剂进行超声提取 ，样品提取液离心后得到上清液经 HLB 固相萃取小柱净化，用 Agilent ZORBAX Eclipse XDB - C18柱 (I.8µm,2.1 mm X 5O mm), 乙经-水作为流动相梯度洗脱 ，流速 0.3mL/min, 柱温 25℃,进样量210μL，糖皮质激素雄激素孕激素采用正离子扫描模式，雌激素采用负离子扫描榄式 ，多反应监测测定。化妆品样品平均加标回收率为 72.31% -97.89%, 相对标准偏差为 2.24%-11.34%, 方法检出限为 0.002 mg/kg-0.8 mg/kg。