防晒霜中过滤剂检测方案(二手分析仪器)

Limian Zhao 安捷伦科技有限公司 化学防晒霜配方中含有紫外线 (UV)过滤化合物，可预防皮肤晒伤和DNA 损伤。本应用简报开发并验证了一种对样品进行前处理，然后对防晒产品中的活性 UV 过滤剂成分进行定量分析的可靠方法。在进行 HPLC分析前，采用有机萃取，然后通过膜过滤，从防晒乳液中提取活性成分。虽然参比标准分析物的保留时间重现性极佳(%RSD≤0.11)，但在色谱柱上连续进样防晒霜样品时，观察到严重的保留时间漂移、基线漂移和峰形不规则。使用 Agilent Captiva EMR-Lipid色谱柱解决了色谱问题，去除了提取样品中的基质脂质。结果实现了可接受的定量准确度和回收率水平(95%-103.5%)，提高了连续进样7种非处方防晒产品中所有紫外线过滤剂保留时间的一致性。 化学防晒产品中的活性成分是 FDA 批准的芳香族化合物，在紫外线范围内具有较高摩尔吸收率。这些紫外线过滤化合物与保湿剂、乳化剂和增稠剂结合在一起，可制得稳定配方，其中的活性成分可用于保护皮肤免受紫外线辐射。 需要进行定量分析测试，以确保非处方(OTC)防晒产品能提供广谱保护且满足美国联邦法规要求。防晒霜配方复杂基质和活性成分的紫外线吸收率使 HPLC 成为当前首选方法，以确保产品一致性和质量。但是，这些产品中存在的基质脂质会导致色谱重现性较差，从而造成色谱柱污染以及方法准确度和精密度不可靠。本应用简报讨论了一种简单的样品前处理技术，可在使用 Captiva EMR-Lipid 色谱柱分析防晒产品时提高色谱重现性并延长色谱柱寿命。 试剂与标准品 HPLC 级水、HPLC 级异丙醇 (IPA)和5种FDA 批准的紫外线过滤剂(通常用于配制防晒霜2)的USP参比标样购自Sigma-Aldrich (表1)。混合每种参比标样10mg，将其溶解在IPA中，使每种化合物的最终浓度达到2 mg/mL， 制得标准混合储备液。该储备液作为最高校准浓度水平(5级)，还配制了四个连续稀释 的储备液用作中间校准浓度，其中每种化合物浓度为1(4级)、0.5(3级)、0.25(2级)以及 0.125 mg/mL(1级)。 消耗品 ( 以下消耗品用于样品前处理： ) ( 15mL 离心管 (Celltreat 部件号 229412) ) ( Agilent 6 mL Captiva EMR-Lipid 过滤柱 (部件号5190-1004) ) ( 10 mL NORM-JECT Luer Slip 进样针 (Henke Sass Wolf 部件号 4100-000V0) ) ( 安捷伦接头：1、3 3、6mL(部件号 12131001) ) ( 安捷伦优级0.2 um 玻璃纤维/尼龙针 头过滤器(部件号5190-5132) ) 表1.紫外线过滤剂参比标样的化学特性 ( 安捷伦2mL棕色螺口盖样品瓶(部件号5182-0716) ) ( 安捷伦螺口盖 PTFE/红色硅胶隔垫 (部件号5190-7024) ) 从个人护理产品中提取和净化紫外线过滤剂 ( 用分析天平将100 mg 防晒霜或润唇膏直 接称入15mL 离心管中。开始提取时，将 2mL热水(85至95C)加入试管中，将样品剧烈振摇并涡旋混合2分钟。将 10 mL IPA 等分试样加入试管中，再次涡 旋混合2分钟，然后超声处理10分钟。为促进进一步溶剂化和分散，将样品以相 同方式再次进行涡旋混合和超声处理。 ) 为促进液相和固相的分离，将样品在2500 rpm 下离心15分钟。弃去沉淀块并将一半左右的上清液小心转移到6mLAgilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱中。将接头塞盖在过滤柱顶部，并用10mLLuer Slip 进样针对样品施加正压。样品混合物以每滴3-5秒的流速低压通过过滤柱。将洗脱液收集到洁净的15mL 锥形离心管中。在前半部分流过后，将其余样品转移到 EMR 过滤柱中。采用安捷伦优级0.2 pm 玻璃纤维/尼龙针头过滤器过滤样品去除颗粒，直接加入至2mL棕色玻璃样品瓶中。 仪器配置 本分析使用由 Agilent ChemStation软件(版本 C.01.09)控制并配备四元泵、真空脱气机、自动进样器、色谱柱热交换器和二极管阵列列测器(DAD)的Agilent 1260 Infinity ll液相色谱系统。使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(3.0 mm x 50 mm， 2.7 pm)和InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 保护柱(2.1 mmx 5 mm， 2.7 um) 进行色谱分离。进样量为1pL， 进样之间用 IPA 清洗针头3次。用于分析物分离的等度流动相、流速和和温箱为安捷伦专有。 DAD在238 nm 波长下用于数据采集。分析停止时间为11分钟。每次样品分析后均运行不进样的空白，在该过程中，用95%IPA 冲洗色谱柱，并在下一次进样前用流动相重新平衡。 ( 保留时间、峰宽(半峰高)、峰对称性、 USP 拖尾因子和分离度值证实了参比混标 中六种成分出色的基线分离度(表2)。 图2为混标的六次重复进样色谱图。该方 法提供了出色的保留时间重现性，所有六 个参比标样峰的 RSD% 介于 0.06-0.11， 峰面积RSD<0.41%。 ) 图1.参比混标中紫外线过滤剂的色谱洗脱曲线 表2.参比混标进样中六种分析物的保留时间(分钟)、峰宽(半峰高)、峰对称性、USP拖尾因子和分离度值 峰编号 分析物名称 保留时间 半峰宽 对称性 USP拖尾 分离度 1 奥克立林 4.922 0.150 0.85 1.158 无数据 2 奥西诺酯 6.011 0.174 0.85 1.154 3.97 3 阿伏苯宗 6.716 0.186 0.90 1.121 2.31 4 顺式胡莫柳酯 7.742 0.210 0.86 1.105 3.06 5 奥替柳酯 8.779 0.234 0.93 1.082 2.76 6 反式胡莫柳酯 9.870 0.260 0.94 1.074 2.61 线性 将峰面积相对参比混标相应浓度 (0.125-2 mg/mL)作图，可为每种过滤剂生成线性校准曲线。图3为五种紫外线过滤剂的线性曲线和相应相关系数(R²)。所有5条线性曲线的R值均>0.999，表明峰面积与每种参比标样浓度之间在校准范围内存在线性关系。 图2.参比混标的六次重复进样的叠加色谱图 奥克立林 奥西诺酯 阿伏苯宗 胡莫柳酯(顺式+反式) 奥替柳酯 图3.紫外线过滤剂参比标样的校准曲线线性和相关系数 未经 Captiva EMR-Lipid 净化的 OTC 防晒产品样品色谱分析 从两种市售 OTC 防晒乳液(防晒霜A和B)中提取活性成分，采用0.45 um尼龙膜针头过滤器 (Sigma-Aldrich) 过滤，不经进一步净化即进样至色谱柱。图4和图5为防晒霜样品与参比混标的叠加色谱图。防晒霜A提取的样品中未经净化的序列显示了所有六个预期峰，保留时间分别与参比混标相同。但是，在系统不运行净化的情况下连续进样防晒霜A提取样品，色谱图开始表现出更明显的保留时间漂移(图4)，表明即使进样间的有机物相清洗浓度很高，也会累积色谱柱污染。 图4.连续进样三个防晒霜A提取的样品(不经净化)与参比混标的叠加色谱图 在三个未净化的防晒霜B提取样品中观察到了相同的问题，这些样品在防晒霜A样品后立即进样(图5)。交换保护柱并反冲洗分析柱刚开始会略微校正保留时间漂移，但其他严重的色谱问题(包括峰形不规则和基线漂移)在随后每次进样混标时会变得更加明显(图6)。仅进样200次后，色普柱就无法再用。有趣的是，进样到色谱柱的大部分样品(97%)是纯标准品，表明仅是由于未净化基质样品的六次进样(图4和图5)就完全损坏了分析柱。 图5.连续进样三个防晒霜B提取的样品(不经净化)与参比混标的叠加色谱图 图6.六次防晒霜样品进样后连续进样参比标样 提取后采用 Captiva EMR-Lipid 净化对色谱分析的改进 为了解决由复杂样品基质导致的明显色谱性能下降，在提取样品后使用了 CaptivaEMR-Lipid 净化。活性成分从六种市售OTC 防晒乳液和 OTC 润唇膏中提取。每种产品的配方中含两种至五种活性紫外线过滤剂。 Captiva EMR-Lipid 过滤柱用于进一步清洁样品粗提物，以去除基质脂质。安装新的分析柱和保护柱，每种产品均进行三次重复提取，并进行两次重复进样分析。图7显示了采用 Captiva EMR-Lipid 净化从每种产品(A到G)中提取样品的代表性色谱图。根据每种 OTC 配方中存在的活性成分，所有样品均得到了预期峰，保留时间与相应标准品和校准范围内的峰面积一致。在进样到色谱柱的七种不同产品样品的六次重复样品连续进样中，均未观察到保留时间漂移或其他色谱问题。 1.奥克立林 2.奥西诺酯 3.阿伏苯宗 4.顺式胡莫柳酯 5.奥替柳酯 6.反式胡莫柳酯 图 7. 0TC防晒乳液(A、B、C、D、E、F)和润唇膏(G)样品的六幅代表性叠加色谱图 表3列出 OTC 样品分析的定量结果。在所有42次样品进样中，活性紫外线过滤剂成分的回收率百分比为95.0%-103.5%，回收率 RSD ≤ 2.19%。七种产品中每个紫外线过滤剂的平均回收率为95.1%-101.1%。由于所有产品样品重复测定的定量结果均在可接受的置信度范围内(回收率95%-105%)，因此该分析方法符合所有测试产品准确度和回收率的可接受标准。同一根色谱柱用于执行600多次进样并测定150种 OTC 产品样品中紫外线过滤剂回收率的可接受水平，仍然保持了高质量色谱性能。 表3.从七种不同 OTC 产品样品中提取的紫外线过滤剂(经 Captiva EMR-Lipid 净化)的平均回收率(%)、标准偏差和RSD% (每个产品n=6) 防晒乳液A 奥克立林 奥西诺酯 阿伏苯宗 胡莫柳酯 奥替柳酯 平均回收率(%) 98.67 97.63 100.22 98.92 97.63 标准偏差 2.16 1.94 2.20 2.12 1.97 % RSD 2.18 1.99 2.19 2.15 2.02 防晒乳液B 奥克立林 奥西诺酯 阿伏苯宗 胡莫柳酯 平均回收率(%) 97.25 97.71 99.39 100.46 标准偏差 1.58 1.47 1.48 1.62 %RSD 1.63 1.50 1.49 1.62 防晒乳液C 奥克立林 阿伏苯宗 胡莫柳酯 奥替柳酯 平均回收率(%) 98.55 97.5 95.58 100.13 标准偏差 0.60 0.62 0.58 0.49 %RSD 0.60 0.64 0.61 0.49 防晒乳液D 奥克立林 奥西诺酯 阿伏苯宗 胡莫柳酯 平均回收率(%) 99.46 98.76 100.14 101.01 标准偏差 0.72 1.26 1.35 1.48 %RSD 0.73 1.28 1.34 1.46 防晒乳液E 奥克立林 阿伏苯宗 胡莫柳酯 奥替柳酯 平均回收率(%) 100.46 100.28 99.04 100.63 标准偏差 1.52 1.82 1.17 0.95 %RSD 1.51 1.81 1.19 0.94 防晒乳液F 奥西诺酯 奥替柳酯 平均回收率(%) 98.18 95.25 标准偏差 0.26 0.20 % RSD 0.26 0.21 润唇膏 奥西诺酯 阿伏苯宗 平均回收率(%) 95.68 99.52 标准偏差 0.70 0.71 %RSD 0.73 0.72 ( U.S. Department of Health and Human Services Food and DrugAdministration Center for Drug Evaluation and Research (CDER).Labeling and Effectiveness Testing：Sunscreen Drug Products for Over-The-Counter Human Use— Small Entity Compliance Guide.https：//www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/labeling-and-effectiveness-testing-sunscreen-drug-products-over-counter-human-use-small-entity. 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