利妥昔单抗生物仿制药与创新药物中电荷异构体及聚集体检测方案(液相色谱仪)

Bian Yulan 全球解决方案开发中心 全球实验室解决方案营销部 (LSS) 安捷伦科技新加坡(销售)私人 有限公司 利妥昔单抗创新药物和生物仿制药的电荷异构体及聚集体分析 单克隆抗体是用于治疗各种疾病的一类重要的生物分子。生物仿制药是创新药物分子的复制品，需要详细表征其关键质量属性 (CQA)，例如聚集体和电荷异构体。与创新药物相比，这些属性必须处于一定范围内才可获得监管机构批准。本研究采用基于 Agilent 1260 Infinity ⅡI生物惰性液相色谱和 Agilent AdvancedBio 色谱柱的两种分析工作流程，对不同制造商生产的两种利妥昔单抗生物仿制药与创新药物的聚集体和电荷异构体图谱进行了比较。结果显示了创新药物与生物仿制药在聚集体和电荷异构体图谱方面的相似性或差异性。生物仿制药1与创新药物在聚集体和电荷异构体方面的相似性高于生物仿制药2。方法表现出优异的日内和日间重现性。 AgilentOpenLab CDS 软件的 Peak Explorer 功能使数据审查一目了然。本研究是一系列利妥昔单抗生物相似性研究的一部分。 单克隆抗体(mAb)药物是制药市场上增长最快的生物治疗药物之一。大多数mAb 用于治疗癌症。mAb 创新药物在发现、开发、生产和临床试验方面投资巨大，这也导致患者接受创新药物治疗的费用通常很高。因此，创新药物的廉价仿制药(称为“生物仿制药”)的需求量很大。第一款生物仿制药于2006年获准进入欧洲市场，进入美国市场则是在九年后，此时美国已于2010年3月实施《平价医疗法案》。由于创新药物分子专利到期，生物仿制药的开发越来越受关注。 为了使生物仿制药获得监管机构批准，制造商需要证明其生物制剂与对照品之间在安全性、纯度和效价方面不存在具有临床意义的差异。在这一过程中，关键在于开展广泛的比较分析研究，以了解创新药物与生物仿制药之间的理化相似性。 聚集体、截短体和其他修饰形式(脱酰胺、异构化等)是在生产过程或储存过程中产生的与产品相关的杂质。药物中存在这些杂质时，会影响药物的稳定性、活性和有效性。因此，，它们通常被视为CQA， 并且在整个生产过程中受到密切监控和检测3。 本应用简报使用两种分析工作流程展示了两种利妥昔单抗生物仿制药与其创新药物之间在聚集体和异构体方面的比较结果。众所周知，利妥昔单抗是一种生物治疗药物，用于治疗类风湿性关节炎、狼疮、血管炎和皮肌炎。两种生物仿制药来自两家位于不同地理位置的制造商。两种工作流程均基于配备 AdvancedBio 色谱柱和OpenLab CDS 的 1260 Infinity ⅡI生物惰性液相色谱系统。在弱阳离子交子 (WCX)色谱柱上分离电荷异构体，在体积排阻(SEC)色谱柱上分离聚集体。图1详细展示了两种工作流程。日内结果和日间结果具有良好的重现性，确保了工作流程的可靠性，并清晰地展示了创新药物与生物仿制药之间的相似性和差异性。 仪器 该系统包括以下模块： ( Agilent 1260 Infinity ll生物惰性泵 (G5654A) ) ( Agilent 1 260 Infinity ll生物惰性 Multisampler (G5668A)， 配备样品 冷却装置 ) ( Agilent 1 260 Infinit y ll 高容量柱温箱 (G7116A)，配备生物惰性热交换器 ) ( Agilent 1260 Infin i ty ll二极管阵列检测器 WR (G7115A)，配备生物惰性 流通池 ) ( Agilent 1260 Infinity Ⅱ生物惰性多检 测器套装 (MDS) (G7805A)， 配备双角度静态和动态光散射 (DLS) 检测器 (G7809A) ) ( 色谱柱 ) ( Agilent Bio mAb 非多孔色谱柱， 2.1×250 mm，5 um HPLC， PEEK (部 件号5190-2411)，用于电荷异构体 分析 ) ( Agilent AdvanceBio SEC 300A， 7.8×300 mm， 2.7pm(部件号 PL1180-5301)，用于聚集体分析 ) ( 软件 ) ( Agilent OpenLab CDS 2.3版 ) ( 安捷伦缓冲液顾问软件A.01.01[009] ) ( Agilent Bio-SEC 软件 ， 版本 A.02.01 Build 9.34851[21] ) 使用 Agilent OpenLab CDS 2.3版软件进行液相色谱仪控制和液相色谱数据分析。它提供了直观的用户界面，并具有可采用拖放式模板创建的定制化交互式报告功能。利用该软件的 Peak Explorer 功能比较创新药物与生物仿制药的分析结果。 化学品和样品 ( 所有溶剂均为液相色谱级。新制超纯水产自配置 0.22 pm 膜式终端过滤器(Millipak) 的 M illi-QIntegral 水纯化系统。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和氯化钠购自Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis， U SA).mAb 药物(包括创新药物和两种生物仿制药)购自当地经销商。在 DLS系统中进 行分析之前，用0.1 um 亲水性 PTFE 滤膜 (Merck Millipore) 将流动相过滤三次。 ) 从原装容器中取出样品，在13000g下离心2分钟。将上清液分装到液相色谱样品瓶中进行分析。 利妥昔单抗mAb(创新药物和生物仿制药) Agilent 1260 Infinity lI生物惰性液相色谱系统 缓冲液顾问软件 ·利妥昔单抗 mAb 样品购自当地经销商 ·使用缓冲液顾问软件快速筛选缓冲液条件 ·使用配备 BioMab WCX 色谱柱的 Agilent 1260 Infinity I ·使用 Agilent OpenLab CDS 2.3进行数据分析和报告 生物惰性液相色谱系统分离电荷异构体 ·利妥昔单抗 mAb 样品购自当地经销商 ·使用1260 Infinity Ⅱl生物惰性液相色谱系统和 AdvanceBio SEC 色谱柱对单体和高分子量聚集体进行分离和定量 ·使用缓冲液顾问软件快速筛选缓冲液条件 ·使用动态光散射检测器测定溶液的分子量和 ·使用 Agilent OpenLab CDS 2.3 和Bio-SEC 软件进行数据分析和报告 图1.用于分析利妥昔单抗创新药物和生物仿制药的电荷异构体和聚集体分析工作流程 电荷异构体：表1列出了用于利妥昔单抗创新药物和生物仿制药离子交换色谱分析的色谱参数。该研究中所用的梯度由缓冲液顾问软件计算得出。将样品直接进样，无需稀释(10 mg/mL)。利用保留时间(RT)、峰面积和峰面积百分比计算相对标准偏差 (RSD %)值。利用相对峰面积百分比对 mAb的电荷异构体进行定量。 聚集体分析：表2列出了用于利妥昔单抗创新药物和生物仿制药的聚集体分析的色谱参数。将样品直接进样，无需稀释(10 mg/mL)。利用RT、峰面积和峰面积百分比计算 RSD%值。利用相对峰面积百分比对样品中的高分子量物质(HMWS)和低分子量物质 (LMWS) 进行定量。通过DLS 分析获得利妥昔单抗的平均分子量和流体动力学半径。 电荷异构体(IEX) 图2所示为使用 BioMAb PEEK 色谱柱得到的创新药物和生物仿制药的电荷异构体图谱，表明电荷异构体在16分钟内实现了高分离度分离。利妥昔单抗创新药物和生物仿制药重复测定六次得到的叠加图表现出优异的重现性。主峰和异构体峰的RT和峰面积的 RSD 分别在0.3%和1%以内。 参数 值 盐梯度 0-200 mmol/L NaCl，30 mmol/L 磷酸钠缓冲液，pH 6.8 时间(min) A)水 B)NaCl C) NaH2PO D)Na2HPO4 (1000 mmol/L) (55 mmol/L) (50 mmol/L) 0.0 43.1 0.0 31.0 25.9 30.0 22.3 20.0 22.7 35.0 35.0 22.3 20.0 22.7 35.0 停止时间 35 min 后运行时间 30 min 流速 0.25 mL/min 进样量 2pL 进样器温度 10°C 柱温 25°℃ DAD 280 nm/4 nm， 参比波长：关闭 峰宽 >0.025 min (10 Hz) 表2.聚集体分析色谱条件 参数 值 流动相 100 mmol/L 磷酸钠缓冲液+150 mmol/L NaCl， pH 7.0 流速 0.8mL/min 停止时间 20 min 进样量 10 pL(用于UV)/25 pL(用于DLS) 进样器温度 10°C 柱温 25°℃ DAD 280 nm/4 nm，参比波长：关闭 峰宽 >0.05 min (1.0秒响应时间) (5Hz) LS检测器 25°℃ DLS操作参数 相关器运行时间 5s 相关器功能片段时间 (Clip Time) 10ps R² 0.80 洗脱液粘度 0.0079(30℃下水的粘度) 洗脱液折射率 1.333(水的折射率) 图3显示了用于比较创新药物和生物仿制药的叠加色谱图。约12.5分钟处的峰归属于主峰，而主峰左侧和右侧的峰则分别归属于酸性和碱性电荷异构体。创新药物与生物仿制药1之间的酸性异构体图 谱相似，而生物仿制药2则略有不同。主要由赖氨酸截短产生的碱性异构体的图谱显示，由于赖氨酸截短不完全，生物仿制药2与创新药物之间存在巨大差异4。 创新药物 日内(n=6) 日间(n=6) RT%RSD 峰面积RSD% RT%RSD 峰面积RSD% 酸性异构体 0.12 0.42 0.31 0.68 主峰 0.10 0.15 0.29 0.50 碱性异构体 0.10 0.90 0.28 1.91 日内(n=6) 日间(n=6) RT 峰面积 RT 峰面积 生物仿制药1 %RSD RSD% %RSD RSD% 酸性异构体 0.08 0.60 0.16 1.07 主峰 0.07 0.32 0.15 0.85 碱性异构体 0.07 0.75 0.14 1.05 日内(n=6) 日间(n=6) RT 峰面积 RT 峰面积 生物仿制药2 %RSD RSD% %RSD RSD% 酸性异构体 0.20 0.19 0.26 0.80 主峰 0.21 0.52 0.25 0.89 碱性异构体 0.22 0.32 0.26 0.70 图2.采用配备 Agilent Bio Mab， 2.1×250 mm， 5 pm， PEEK 色谱柱的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统对利妥昔单抗创新药物和生物仿制药样品进行六次重复测定所得到的叠加图。图中表格显示了主峰和电荷异构体的保留时间和峰面积的精密度，n=6 图3.利妥昔单抗创新药物和生物仿制药的电荷异构体图谱比较的放大图 图4显示了创新药物和生物仿制药之间的电荷异构体和主要形式分布。结果表明，利妥昔单抗创新药物中的主要形式占65.35%±0.27%，生物仿制药1中的主要形式占65.14%±0.10%，但是在生物仿制药2中仅占 28.8%±0.07%。与创新药物(12.97%±0.23%)相比，利妥昔单抗生物仿制药2的主要电荷异构体为碱性异构体，占62.99%±0.06%。创新药物与生物仿制药1的电荷异构体图谱相似，不同之处仅在于生物仿制药1表现出的碱性异构体略多一些(20.11%±0.12%VS.12.97%±0.23%)，而酸性异构体则较少一些(14.53%±0.09%Vs.21.68%±0.13%)。 OpenLab CDS 中另一种有用的数据分析功能是 Peak Explorer。该功能实现了大数据集的可视化，可以发现变化趋势、保留时间漂移、异常值和伪峰等，从而加快复杂样品的数据审查。利用 PeakExplorer 查看电荷异构体数据，并对创新药物和生物仿制药进行比较。图5显示了利用 Peak Explorer 对创新药物和生物仿制药的比较结果。各个气泡对应于酸性和碱性异构体以及主峰。气泡的大小代表异构体的峰面积百分比。 Peak Explorer所示的比较结果与图4的结论一致。 聚集体分析 图6所示为创新药物和生物仿制药的聚集体图谱，表明在20分钟内实现了聚集体的高分离度分离。创新药物和生物仿制药重复测定六次得到的叠加图表现出优异的重现性。主峰和异构体峰的 RT 和峰面积的 RSD 分别在 0.1%和2%以内。 图4.创新药物与生物仿制药之间电荷异构体(酸性异构体、主峰和碱性异构体)峰面积百分比的比较 保留时间(min) 图 5. Peak Explorer 数据显示快照。X轴为保留时间，Y轴为所加载数据集中的进样编号。每个气泡代表各个异构体和主峰。气泡大小代表峰面积百分比 ×10 创新药物 5.0 5.4 5.8 6.2 6.6 7.0 .7.4 7.8 8.2 8.6 9.0 9.4 9.8 10.2 10.611.011.411.812.2 保留时间 (min) 图6.采用配备 Agilent AdvancedBio SEC， 7.8×300 mm， 2.7 um 色谱柱的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统对利妥昔单抗创新药物和生物仿制药样品进行六次重复测定所得到的叠加图。表中显示了 HMWS、单体和 LMWS的保留时间和峰面积的精密度，n=6 图7显示了用于比较创新药物和生物仿制药的叠加色谱图。约8.4分钟处的峰归属于单体，而主峰左侧和右侧的峰则分别归属于HMWS和 LMWS。如图所示，各个样品中的 LMWS 峰面积百分比相似 (分别为0.08%、0.08%和0.11%)，而HMWS 则表现出不同的情况；创新药物与生物仿制药2之间的差异比起与生物仿制药1的差异更突出。 图8显示了样品中 HMWS、LMWS和单体的分布。所有三个样品中的单体峰均占98%-99%。在两种生物仿制药中，观察到的 HMWS 水平均略高一些(分别为0.93%±0.01%和0.94%±0.01%)。 而且，与创新药物 (0.08%)和生物仿制药1(0.08%)相比，生物仿制药2表现出更高的 LMWS 水平(0.11%)。但是，所有差异都非常小。 图9展示了利用配备 DLS检测器的bio-MDS 系统获得的结果。mAb单体的绝对平均分子量与流体动力学半径(Rh) 都可以直接从结果中读取。结果表明，DLS分析具有良好的重现性，并且能够准确测定分子量和 Rh 值。 图 9.通过 DLS分析得到的创新药物和生物仿制药之间的平均分子量和 Rh 的比较 本应用简报展示了两种用于分析利妥昔单抗创新药物及其两种生物仿制药的分析工作流程，即电荷异构体和聚集体分析。在两种工作流程中，RT和峰面积均获得了良好的重现性。电荷异构体分析结果表明，生物仿制药2样品存在明显差异，其中较高百分比的碱性异构体被认为是赖氨酸截短异构体。聚集体分析结果表明，生物仿制药2的 HMWS图谱与创新药物略有不同。在药物样品的电荷异构体和聚集体异构体特性方面，生物仿制药1与创新药物具有更高的相似度。这些结果与已发表的利妥昔单抗表征数据相吻合合，表明安捷伦电荷异构体和聚集体分析工作流程在生物仿制药相似性研究中表现可靠。为便于以批处理模式轻松审查数据并提高分析效率， Agilent Openlab CDS 软件提供了 Peak Explore 等功能。 ( 参考文献 ) ( 1. D ubel， S.； Reichert， J.M. Handbook of Therapeutic Antibodies， second edition ) ( 2. U.S. Public Health Service Act section 351(k) ) ( 3. ICH Harmonized TripartiteGuideline Specifications： TestProcedures and Acceptance Criteriafor Biotechnological/BiologicalProducts Q6B ) 4. ( Suresh Babu， C. V. ChargeHeterogeneity Analysis of Rituximab Innovator and Biosimilar mAbs (利妥昔单抗创新药物和生物仿制药 mAb的电荷异质性分析)，安捷伦科技公司应用简报，出版号5991- 5557EN ) ( 5. Lee， K. H. e t a l. Analytical Similarity Assessment of Rituximab Biosimilar CT-P10 to Reference Medicinal Product. Mabs 2018， 10(3)， 380-396 ) www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( C安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) ( 2019年10月28日， 中国出版 ) 5994-1496ZHCN DE.0897222222 单克隆抗体是用于治疗各种疾病的一类重要的生物分子。生物仿制药是创新药物分子的复制品，需要详细表征其关键质量属性 (CQA)，例如聚集体和电荷异构体。与创新药物相比，这些属性必须处于一定范围内才可获得监管机构批准。本研究采用基于 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱和 Agilent AdvancedBio 色谱柱的两种分析工作流程，对不同制造商生产的两种利妥昔单抗生物仿制药与创新药物的聚集体和电荷异构体图谱进行了比较。结果显示了创新药物与生物仿制药在聚集体和电荷异构体图谱方面的相似性或差异性。生物仿制药 1 与创新药物在聚集体和电荷异构体方面的相似性高于生物仿制药 2。方法表现出优异的日内和日间重现性。Agilent OpenLab CDS 软件的 Peak Explorer 功能使数据审查一目了然。本研究是一系列利妥昔单抗生物相似性研究的一部分。