22 种不同活性药物中(API) 的纯度检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent制药与生物制药Trusted Answers 使用安捷伦 LC/MSD iQ 质量选择检测器和 WalkUp 软件快速确证 API纯度 Kyle Covert和 Robert Ley 安捷伦科技有限公司 Santa Clara，CA， USA 本应用简报展示在基于 UV的方法中增加质谱信息，如何能显著提高色谱效率。通过增加质谱信息，快速色谱方法能够轻松区分共洗脱物质，这些化合物对UV检测器响应较差或不包含发色团时更是如此。在某些情况下，与仅基于 UV 的工作流程相比，痕量化合物的检测限可提升100倍。在本应用简报中，联用 Agilent InfinityLabLC/MSD iQ 系统和 Agilent MassHunter WalkUp，在开放式环境中分析了22种不同活性药物成分 (API) 的纯度。 InfinityLab LC/MSD iQ 是一种强大的自我感知型智能质谱检测器，，可将质谱信息添加到标准 HPLC 工作流程中。MassHunter WalkUp 这款软件可使 LC/MS系统在开放式访问环境中使用。 在 API的成成过程中，需要对许多反应步骤进行监测。为确保创建可靠且性价比高的合成途径，必须测试每个反应步骤的整体纯度和收率。快速获得结果，是为下一步做出恰当决策的关键基础。通过添加质谱信息，可采用更快的液相色谱分离方法，因为质谱检测可以鉴定共洗脱分析物。此外，可以减少或无需使用 UV 检测所需的运行标准品。此外，由于涉及质谱检测的实施方法十分复杂，一些实验室与外部分析团队合作测试API的纯度。InfinityLab LC/MSD iQ 单四极杆质谱仪以及 MassHunter WalkUp 软件通过提供包含质量确认的直观开放式系统，降低了上述复杂性。 InfinityLab LC/MSD iQ 单四极杆质量选择检测器(MSD)具有出色的可靠性，具有智能诊断功能，可在低流速到高流速下操作。它还可以自动优化 MS 参数，以在名为“自动采集”(Auto Acquire) 的智能自动采集模式下获取最佳结果。色谱工 作人员只需将其添加到现有 Agilent 1260Infinity Ⅱ或 1290 Infinity lI 液相色谱堆栈中，即可使用该系统，也可无缝集成到上一代安捷伦液相色谱仪堆栈中。 该仪器使用 MassHunter WalkUp 软件，可以用作开放式系统。WalkUp用户有两种： 系统管理员 样品提交人员 方法由管理员控制，，可在受控环境下提交样品。由于 WalkUp 在采集和数据分析软件上运行，因此提交者无需预先具备Agilent OpenLab CDS 的知识即可操作该仪器。他们只需使用 WalkUp 的快速样品提交用户界面提交样品，该界面无需任何培训即可使用，如图1所示。 标准品与化学品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 或 LC/MS级。乙腈购自 Honeywell (Morristown，NJ， USA)。所有 API均购自 Millipore-Sigma (Merck， Darmstadt， Germany)。超纯水产自配备 LC-Pak Polisher 和0.22 um 膜式终端过滤器滤芯的 Milli-QIntegral 系统 (EMD Millipore， Billerica，MA， USA)。 仪器 分析系统包括以下模块： Agilent 1290 Infinity lI高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity Ⅱ样品瓶进样器(G7129B) Agilent 1290 Infinity lI 高容量柱温箱(G7116B) Agilent 1290 Infinity ll二极管阵列检测器(G7117B) Agilent InfinityLab LC/MSD iQ(G6160A) DAD， 配备安捷伦60 mm 最大光强卡套式流通池 (G4212-60007)，用于最大限度提高 UV检测器的灵敏度。 样品前处理 将 API标准品称量至15mL Falcon 管中，根据其溶解度，用乙腈或甲醇稀释至10 ug/mL 的浓度。立即对样品进行分析，并在室温下静置于溶液中三个月以上，来模拟储存降解状况。用标称质量作为样品纯度分析的目标质量进行API分析。 丁螺环酮 385 氯氮平 326 西替利嗪 388 紫杉醇 853 阿司匹林 180 氯雷他定 382 非索非那定 501 苯妥英 252 咖啡因 194 布洛芬 206 奥美拉唑 345 卡铂 371 表 2. Agilent 1290 Infinity II液相色谱方法参数 参数 HPLC 设定值 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 2.1×50 mm，1.9 pm， 40℃(部件号699675-902) 流动相A 0.1%甲酸水溶液 流动相B 0.1%甲酸乙腈溶液 梯度 时间(min) %B 0.00 51.75 902.90 90 3.00 5 后运行 0.7 min 流速 0.8 mL/min 进样量 1pL 检测 UV [254，5/参比波长360， 80] nm 表3.“自动采集”自动创建的 Agilent InfinityLabLC/MSD iQ 参数 参数 LC/MSD iQ 设定值 离子源 ESI± 采集模式 自动采集模式 点/秒 2 扫描范围 m/z 100-1000 OpenLab CDS 使用 Agilent OpenLab CDS 软件进行数据采集、处理和报告。OpenLab CDS 提供法规认证功能，可根据美国 FDA 21 CFRPart 11、欧盟附录11及其他类似法规提供数据可靠性支持。1290 Infinity II LC 和LC/MSD iQ 旨在确保 GxP 实验室常规应用中可靠且稳定的 LC/MS 分析。 MassHunter WalkUp 软件 MassHunter WalkUp 是一款开放式安捷伦软件，是 OpenLab CDS、ChemStation和 MassHunter 采集平台的附加组件。WalkUp 是位于常规数据采集上方的控制软件，并提供简单的用户界面来提交样品。 用于样品纯度评估的额外MS 信息 在 HPLC 工作流程中，额外添加 MSD 检测使用户可以在其分析中添加其他维度信息。此外， MSD 可检测到在UV 中吸收差或不含活性发色团的化合物。还提供了共洗脱分析物的明确信息，仅靠UV 检测无法分辨。借助质谱信息可更轻松地鉴定杂质，既无需分析标准品，也节省了运行上述标准品来确定保留时间所需的时间。从而可以快速进行样品纯度评估，无需掌握预期保留时间。 已知 API 红霉素在 UV 光谱中吸收较差。在与 API 不同的波长处检测到杂质。在许多情况下，很难获得杂质标准品或有机反应中间体。此外， API 在 210 nm 处的吸收几乎无法与噪音区分，只能通过测量标准品后确定预期保留时间来确认。 图2显示了质谱检测的实用性，可从MS色谱图中看出，该色谱图中有一个大峰，根据其标称质量(733 Da) 鉴定为红霉素。如果没有质谱信息，就不清楚哪个UV峰是杂质，哪个是 APl。 Sample Purity Results 图2.红霉素样品的样品纯度结果。上图显示的是254和210 nm处的UV色谱图(分别为黑色和蓝色迹线)，下图是标有基峰 m/z 和峰面积%的MS色谱图。从 MS数据可以确认，210 nm 处的色谱峰为API(约1.0min)， 254 nm处检出的两个峰为杂质 使用OpenLab CDS 样品纯度工作流程简化反应监测 OpenLab CDS 提供了内置工作流程，可以自动处理数据并生成报告。使用已建立的方法，样品提交者无需执行数据分析，从而节省了宝贵的时间。样品纯度工作流程可让提交者最多输入五个目标质量，以在测量过程中进行监测。测量完成后，将使用从扫描信号中提取的目标质量的特定加合物，自动进行数据处理。然后，自动数据处理根据目标加合物的总EIC 保留时间，在扫描信号中找到匹配的峰。如果找到目标，在报告中将显示为“已找到”，并根据 TIC% 或 EIC/TIC%进行以下计算，来确定样品纯度。 本应用简报使用正离子 TIC% MS样品纯度工作流程，并选择了[M+H]*和[M+Na]*目标加合物，如图3所示。此外，选择[M-H]和[M+HC00] 加合物用于负离子扫描模式。 图 3. Agilent OpenLab CDS 数据分析处理方法选项卡中的 MS 样品纯度处理方法参数。 MS 样品纯度通过TIC%计算确定。选择H*和 Na* 加合物用于正离子扫描模式。选择HCOO~加合物和去质子化分子用于负离子扫描模式。保存参数后，所有测量将自动进行数据处理和报告生成 图4显示了所有22种API 的 OpenLab数据分析和样品纯度结果。，可轻松查看所有进样，未达到最低纯度限或未检测出的API标记为红色。样品提交者会收到每种API的样品纯度报告，类似于图6中的报告。 质谱信息对推断化学反应必不可少 监测整个合成途径中的反应是必要时做出正确决策和调整的关键。确定最佳应对方案需要快速可靠的结果。该模拟降解研究先稀释新制卡托普利，在210 nm 处测量时，该色谱图在 UV 色谱图中显示一个峰。根据质谱信息将其确证为 API。 MS色谱图仅包含一个峰，目标质量的 EIC 对应于单峰；因此样品纯度为100%。正离子 MS 质谱峰在质量数 m/z 218 和457处显示两个峰。前者是 API [M+H]*，后者是钠加成二聚体[2M+Na]*。 图4.用于样品纯度工作流程的 Agilent OpenLab CDS 2.4 数据分析UI。“样品纯度结果”窗口显示了一系列进样的样品纯度结果。每行都包含样品名称，以及基于处理方法中设置的限值(纯样品>90%)，样品属于纯样品还是不纯样品。 UV 和 MS 色谱图显示在右侧，所选峰的 MS 谱图显示如下 在室温下静置三个月后， MS 色谱图有两个峰，正离子/负离子扫描模式的基峰分别在 m/z 218/216 和 433/431。 m/z218对应于[M+H]*加合物，而 m/z 433对应于新物质。如图6B所示， 254nm处的 UV 峰由 m/z 433处的新物质组成，而非 m/z 218 的目标质量。 卡托普利的标称质量为217 Da， m/z 433 可能为[2M-2H+H]*。在观察卡托普利的结构时(图5)，推断随着时间的推移会形成二硫键。在这种情况下，质谱信息对于确定API 的降解产物至关重要。通过检测 m/z433的二硫键二聚体，可以看出卡托普利的样品纯度仅为 58.49%。 图5.卡托普利和二硫键二聚体的分子结构 图6A.新鲜配制的卡托普利。该报告包括顶部的样品纯度结果以及标有 m/z 基峰的 UV 和 MS谱图。目标化合物也有一个EIC， 以显示哪些峰由API组成。MS 谱图显示在右侧，并带有加注标签，以供手动注释 质谱信息对于鉴定 API杂质很有价值。配置质量选择检测器有利于分辨共洗脱分析物。InfinityLab LC/MSD iQ 是与 UV检测结合使用的理想系统，可向分析中添加质谱信息来进行样品纯度工作流程。当样品在UV 中吸收差或很难获取标准品时非常重要。MassHunter WalkUp 可让多个用户使用直观用户界面提交样品，无需具备质谱知识。与 InfinityLab LC/MSD iQ 结合使用，，可确保获得真正的开放式体验，从而快速获得结果，为必须快速做出决策的实验室节省了宝贵时间。 www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限有司， 2019 2019年11月08日， 中国出版 5994-1503ZHCNDE.8889814815 ) 图6B.卡托普利样品在室温下静置三个月后。在0.9分钟处 m/z 433有一种新物质，很可能表明 API的两个分子之间已经形成了二硫键。利用质谱信息，可以轻松鉴定这种新物质。该报告使用 WalkUp 自动生成，将直接通过电子邮件发送给样品提交者。 MS谱图显示在右侧，并带有加注标签，以供手动注释 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： 本应用展示在基于 UV 的方法中增加质谱信息，如何能显著提高色谱效率。通过增加质谱信息，快速色谱方法能够轻松区分共洗脱物质，这些化合物对 UV 检测器响应较差或不包含发色团时更是如此。在某些情况下，与仅基于 UV 的工作流程相比，痕量化合物的检测限可提升 100 倍。在本应用中，联用 Agilent InfinityLab LC/MSD iQ 系统和 Agilent MassHunter WalkUp，在开放式环境中分析了 22 种不同活性药物成分 (API) 的纯度。InfinityLab LC/MSD iQ 是一种强大的自我感知型智能质谱检测器，可将质谱信息添加到标准 HPLC 工作流程中。MassHunter WalkUp 这款软件可使 LC/MS 系统在开放式访问环境中使用。