品牌药和仿制药中痕量杂质检测方案(液质联用仪)

使用自我感知型 Agilent InfinityLabLC/MSD iQ 测量品牌药和仿制药中的痕量杂质 作者 Kyle Covert 博士安捷伦科技公司 本研究展示了一种比较品牌和仿制非处方 (OTC) 对乙酰氨基酚药物中相关杂质的方法。该工作流程包括 Agilent InfinityLab 液相色谱/质谱选择性检测器(LC/MSD iQ) 和Agilent 1290 Infinity ll 液相色谱系统。本研究鉴定的杂质浓度低于使用UV 能够可靠检出的浓度。 前言 多数 OTC 药物都是根据品牌产品开发的 仿制药，无需处方即可购买。这些仿制药 由不同的制造商出售，有助于刺激竞争 并降低价格，使患者更容易负担。仿制 OTC 药品生产企业必须满足与 USFDA 针 对已批准品牌药确定的规格、纯度、稳定 性和相关杂质限度等相同的质量属性 。 仿制药品制造商必须能够表征其产品及其 杂质，通常使用 HPLC 和 UV 检测。添加 质量选择检测器可以大大缩短典型 USP 或 EP方法的分析时间2，因为共洗脱组 分可以由目标化合物的质量明确地确定。 本研究对比了对乙酰氨基酚品牌药和仿制OTC 药中的相关杂质。使用 InfinityLabLC/MSD iQ 和1290 Infinityll液相色谱系统筛查杂质。基于单四极杆技术的LC/MSD iQ 是一款强大耐用的检测系统，其设计重点是简单易用性和可靠性。这是一款直观的仪器，只需极少的用户培训。它可以采用高液相色谱流速，并能自动优化 MS参数， 以提供最佳结果。使用质谱检测能够确保对活性药物成分(API)及其相关杂质，以及更为重要的任何未知或意外杂质进行明确检测。色谱工作人员可以轻松地将 LC/MSD iQ作为新模块加入现有液相色谱堆栈中。此款仪器经过专门设计，可以轻松集成到Agilent 1260 Infinity ll 液相色谱系统、1290 Infinity ll 液相色谱系统甚至更旧型号的液相色谱系统中，其空间设计可插入与液相色谱模块相同的电源插座中。包 括 MS 和真空泵在内的 HPLC堆栈可置于 Agilent InfinityLab Flex Bench MS 移动支架上，从而节省了工作台空间，并可快速安全地移动整个系统。 标准品与化学品 所有试剂和溶剂容为 HPLC 或 LC/MS级。甲醇购自 Honeywell (Morristown，NJ，USA)。对乙酰氨基酚 API 其相关杂质和乙酸的标准品购自Millipore-Sigma(Merck， Darmstadt， Germany)。超纯水产自采用 LC-Pak Polisher 和 0.22 um 膜式终端过滤器滤芯的Milli-Q Integral 系统(EMD Millipore， Billerica， MA， USA)。 OTC 药品样品购自当地药店，品牌产品指定为药品1，仿制产品指定为药品2。 ( 仪器 ) ( LC/MSD iQ 系统包括以下模块： ) ( Agilent 1290 Infinity ll 高速泵 (G7120A) ) ( Agilent 1290 Infinity ⅡI样品瓶进样器 (G7129B) ) ( Agilent 1290 Infinity ll 高容量柱温箱 (G7116B) ) ( Agilent 1290 Infinity ll 二极管阵列检 测器(G7117B) ) ( Agilent LC/MSD iQ (G6160AA) ) ( 将 DAD与 60 mm 安捷伦最大光强卡套式 流通池 (G4212-60007)配套使用 ， 以使 LC/MSD iQ 的 UV检测获得最大灵敏度。 ) 样品前处理 将选定药物杂质标准品称量至15mLFalcon 管中，用甲醇稀释至1 mg/mL的工作浓度，然后超声处理约15分钟。将100 pL 每种标准品加入2mL螺口样品瓶中，并用80：20甲醇/水稀释至1mL。用80：20 甲醇/水进行连续稀释，以制备以下外部校准曲线的浓度：10、5、2.5、1、0.5和 0.1 pg/mL。 OTC药物样品为片剂，每片对乙酰氨基酚(API) 剂量为 500mg。使用甲醇对 API 及其杂质进行简单的液相萃取。将药物片剂置于包含10 mL 甲醇的 15 mL Falcon 管中，折荡30分钟，超声处理约30分钟，然后以 4500 rpm 的转速在离心机中离心约15分钟。然后，从Falcon 管中吸取1 mL 最终溶液到2mL 螺口样品瓶中进行分析，最终 API 浓度为 50 mg/mL。 Agilent OpenLab CDS ( 使用 Agilent OpenLab CDS 软件进行数据 采集、处理和报告。OpenLab CDS 提供法规认证功能，可根据美国 FDA 21 CFR Part 11、欧盟附录11及其他类似法规提供数据可靠性支持。 1 290 Infinity IILC 和 LC/MSD iQ 旨在确保 GxP 实验室常规应用中可靠且稳定的LC/MS分析。 ) 结果与讨论 使用 OpenLab CDS 2.4确定线性校准范围使用 Agilent OpenLab CDS 2.4软件生成校准曲线。在OpenLab CDS 的数据分 析组件中，用户可以轻松查看校准曲线(图1)，并将此数据存储起来，以对测试样品进行自动和快速定量。生成标准品杂质六个浓度的外部校准曲线：0.1、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 pg/mL， 重复测量 三次。上述浓度相当于样品中的2、10、20、50、100和200 ppm API。 选择该范围以包含药物样品中的预期杂质浓度。图2显示了校准曲线，所有目标化合物校准曲线的R²>0.99。 图 1. Agilent OpenLab CDS 的“数据分析”组件界面，及打开的校准曲线选项卡界面。用户可以同屏轻松查看色谱图和校准曲线，并选择校准曲线(可实时更新运算) ×104 对乙酰氨基酚 ×106 4-氨基苯酚 R²=1.000 2.50 含量(ng) 图2.表1中列出的API 和杂质的外标校准曲线。所有目标化合物均测定3次，R²>0.99 分流药物 API 对于保护 MS 检测器至关重要 LC/MSD iQ 设计有内置分流阀，可在存在高浓度样品时方便分析杂质，并确保MS检测器的寿命和耐用性。为避免 MS 检测器过饱和，由于样品中 API浓度很高(50mg/mL)， 当API洗脱时，在 DAD 之后将液流导入废液。首先，在流路中没有 MS的情况下测量样品， I以确定应分流API的时间窗口(图3)。 图3.1pL进样药物样品(含有50 mg/mL 药物 API对乙酰氨基酚)的UV色谱放大图。插图显示了同一次进样的满量程信号图 内置 LC/MSDiQ分流阀设置为从2.5分钟到3.5分钟时将液流导入废液。如图3所示，仅分流了 API，并在第一个杂质开始洗脱前将液流切换回质谱仪。 鉴定 OTC样品中的杂质 表1.标准品 API 和杂质列表 为了优化液相色谱方法以实现充分分离，分别从标准样品中测量了表1中列出的杂质。然后，以10 pg/mL 浓度进样含有API 和杂质标准品的混合样品，进样量为1uL， 以与药物样品进行比较，以确定样品中存在的杂质(图4)。 测量了1pL进样量的药物样品，以选择性离子监测 (SIM)模监监测表1中列出的所有杂质。图5显示药物样品中仅检出部分相关杂质。在药物样品中仅确证了四种杂质：4-氨基苯酚、RC-A、RC-B和RC-D。在本研究中，仅比较了相关化合物图谱的 SIM(图6)，不包括配方中的其他成分。 化合物 g/mol 结构 对乙酰氨基酚 151.2 HO 相关化合物A 193.2 .CH3 CH3 H 相关化合物B 165.2 O CH3 HN OH 相关化合物C 151.2 OH .CH3 O 相关化合物D 135.2 O CH3 相关化合物F 139.1 OH O2N 相关化合物J 169.6 CH3 NH CI 4-氨基苯酚 109.1 OH NH. 表 2. Agilent 1290 Infinity II液相色谱方法参数 参数 HPLC 设定值 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C8， 3.0×150 mm，2.7 pm， 40℃(部件号693975-306) 流动相A 0.1%乙酸水溶液 流动相B 0.1%乙酸甲醇溶液 梯度 时间 %B 0 107 508 80 8.5 80 9.0 10 后运行 2.5 min 流速 0.6 mL/min 进样量 1 pL 检测 UV (265，5/参比波长360，80)，(318，5/无参比) 时间 (min) 图 4.1 pL进样量的 API和杂质标准品(10 pg/mL)的 SIM 质谱图。每个峰采用不同颜色标记。刻度设为相对丰度，以便清晰观察到每个峰 药物1 图5.1pL进样量的药物1样品(含50mg/mL API) 的选定 SIM 提取离子色谱 (EIC) 质谱图。为清晰起见，各 SIM 信号选取±0.5 min 的宽度，插图显示了完整的SIM TIC 色谱图。插图中的宽峰是在与4-氨基苯酚相同m/z (m/z 110)下检出的残留API片段 时间(min) 图 6. OTC药物样品中检出的药物杂质的 SIM EIC 质谱图。蓝色迹线对应药物1，黑色迹线对应药物2。为了清楚起见，截取保留时间附近的杂质 EIC。插图是相同进样量的UV色谱图，显示了许多与表1中杂质无关的其他化合物 比较品牌药和仿制 OTC 药样品 图6显示了药物样品1和2之间针对测量的标准品杂质的对比：4-氨基苯酚、RC-A、RC-B和RC-D。其中最受关注的是RC-D，它药药物1中的丰度比在药物2中的丰度高得多。然而，对于4-氨基苯酚、RC-B和RC-A，药物2中的杂质总丰度更大。表4显示了各药物样品中相对API 检出的杂质含量(ppm)。尽管这些含量远低于 USFDA 推荐的准则3，但表明了品牌药和仿制药之间的杂质成分存在明显差异。 表4.相对 API的药物样品中杂质含量(ppm)。较高浓度以粗体显示 杂质 药物1 相对 API 的 ppm 药物2 相对API 的 ppm 4-氨基苯酚 0.440 1.586 RC-A 3.010 4.960 RC-B 4.260 14.72 RC-D 21.32 未检出 RC-C 未检出 未检出 RC-F 未检出 未检出 RC-J 未检出 未检出 Agilent LC/MSD iQ 可以轻松检出OTC 药品中存在的低至皮克级柱上量(ng/mL)的杂质。分析品牌和仿制 OTC药中的杂质，并进行对比。该品牌药含有四种可检出杂质：4-氨基苯酚、RC-A、RC-B 和 RC-D， 而仿制药含三种可检出杂质：4-氨基苯酚、RC-A和 RC-B。即使对品牌药的分析显示存在更多检出杂质，但仿制药中这些杂质的浓度更高。两种OTC 产品均按照 USFDA 指南3生产，且杂质浓度远低于指南中规定的浓度：15 pg/mL 或 0.03% API。 在这些浓度下(参见表4)， UV 检测器无法可靠地定量这些杂质。此外，在两种API 之间观察到的杂质谱差异可以归因于原材料来源以及制造过程中使用的合成和纯化工艺差异。 ( 1 . Generic Drugs. https：//www.fda.gov/drugs/buying-using-medicine-safely/generic-drugs. USFDA， May 16， 2019. Retrieved July 22， 2019 ) ( 2. Acetaminophen USP Monograph.The United States PharmacopeiaConvention.May 1， 2014 ) 3. ( US Department o f Health andHuman Services； FDA； CDER； CBER.Guidance for Industry Q3B(R2)Impurities in New Drug P roducts. ICH， July 2006，Rev.2 ) www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( C安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) ( 2019年10月8日，中国出版 5994-1431ZHCN ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn 本研究展示了一种比较品牌和仿制非处方 (OTC) 对乙酰氨基酚药物中相关杂质的方法。该工作流程包括 Agilent InfinityLab 液相色谱/质谱选择性检测器 (LC/MSD iQ) 和Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统。本研究鉴定的杂质浓度低于使用 UV 能够可靠检出的浓度。Agilent LC/MSD iQ 可以轻松检出 OTC 药品中存在的低至皮克级柱上量 (ng/mL)的杂质。分析品牌和仿制 OTC 药中的杂质，并进行对比。该品牌药含有四种可检出杂质：4-氨基苯酚、RC-A、RC-B 和 RC-D，而仿制药含三种可检出杂质：4-氨基苯酚、RC-A 和 RC-B。即使对品牌药的分析显示存在更多检出杂质，但仿制药中这些杂质的浓度更高。两种 OTC 产品均按照 USFDA 指南[3] 生产，且杂质浓度远低于指南中规定的浓度：15 μg/mL 或 0.03% API。在这些浓度下，UV 检测器无法可靠地定量这些杂质。此外，在两种 API 之间观察到的杂质谱差异可以归因于原材料来源以及制造过程中使用的合成和纯化工艺差异。