血管紧张素 II 受体阻滞剂 (ARB)中亚硝胺杂质检测方案(液质联用仪)

使用高分辨率 Agilent 6546 LC/Q-TOF测定亚硝胺杂质 Chander Mani 和Saikat Banerjee安捷伦科技有限公司 血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂 (ARB)药物通常用于治疗高血压和心脏衰竭。最近的研究表明，一些ARB 药物产品含有致癌性亚硝胺杂质，导致许多这类药物被召回。因此，行业迫切需要一种常规分析方法，来检测这些致癌性亚硝胺杂质。本应用简报介绍了一种灵敏的高分辨率 LC/MS/MS 方法，其中使用 Agilent 6546 LC/Q-TOF 来检测和定量 USFDA 列出的6种亚硝胺，并展示了同时检测11种亚硝胺杂质。 最近， FDA宣布召回缬沙坦、氯沙坦和厄贝沙坦等ARB药物，因为这些药物中可能含有亚硝胺杂质，这也使得N-亚硝基杂质成为了 FDA 和 EMA等监管机构关注的重点。这些亚硝基化合物被列为可能的人类致癌物，它们是生产过程中的痕量副产物，并由此被引入药物成品中。 本应用简报全面介绍了使用6546 LC/Q-TOF 在低检测限下分析11种亚硝胺杂质。这些杂质的分子量较小，从74到158不等。其中包括： N-亚硝基二甲胺(NDMA) N-亚硝基二乙胺 (NDEA) N-亚硝基-4-甲基-4-氨基丁酸 (NMBA)N-亚硝基异丙胺 (NEIPA) N-亚硝基二异丙胺 (NDIPA) N-亚硝基二丁胺(NDBA) N-亚硝基甲乙胺 (NMEA) N-亚硝基吡咯烷 (NPyR) N-亚硝基哌啶(NPIP) N-甲基-N-亚硝基苯 (NMPhA) N-异丙甲基亚硝胺 (NMIPA) 基于液相色谱-质谱 (LC/MS) 的方法通常具有高灵敏度和高特异性，是开发用于检测和定量所有这些杂质的单一方法的基础。本应用简报展示了高分辨率6546LC/Q-TOF 的高灵敏度。 亚硝胺化合物 化学结构 N-亚硝基二甲胺 (NDMA) CHN HC N N-亚硝基二乙胺 (NDEA) N-亚硝基-4-甲基-4-氨基丁酸(NMBA) N OH N-亚硝基异丙胺 (NEIPA) HC N=0 HC HC N-亚硝基二异丙胺 (NDIPA) N N-亚硝基二丁胺 (NDBA) N N N-亚硝基甲乙胺(NMEA) N NO N-亚硝基吡咯烷(NPyR) N N-亚硝基哌啶 (NPIP) NN N-甲基-N-亚硝基苯(NMPhA) N N-异丙甲基亚硝胺(NMIPA) 表1.UHPLC配置和设置 化学品与试剂 本研究使用的11种亚硝胺标准品均来自PS3 Labs LLP， Hyderabad， TS， India。 其他 LC/MS 分析级溶剂(如甲醇、水)购自Honeywell。甲酸购自 Fluka。 数据分析 采集数据，使用 Agilent MassHunter 软件套装10对6546 LC/Q-TOF 采集的数据进行分析。对个人化合物数据库与谱库(PCDL)进行定制，并将其用于通过分子式查找算法进行化合物鉴定，然后定量化合物。 参数 值 仪器 Agilent 1290 Infinity II高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B) Agilent 1290 Infinity ll 高容量柱温箱 (G7116B) 进样针清洗 甲醇：水(80：20v/v) 样品稀释剂 水 Multisampler 温度 6°C 进样量 40 pL 分析柱 Agilent InfinityLab Poroshell HPH C18， 2.1×100 mm， 1.9 pm (部件号695675-702) 柱温 40°C 流动相A 0.2%甲酸水溶液 流动相B 甲醇 流速 0.4mL/min 梯度 时间 (min) %B 0 1 2 135.5 808 95 10 95 停止时间 10 min 后运行时间 3 min Q-TOF质谱仪配置和参数 表2. MS配置和离子源设置 仪器 Agilent 6546 LC/Q-TOF 离子源 大气压化学电离(APCI) MS模式 MS 电离模式 正离子 干燥气温度 300°℃ 干燥气流速 6 L/min 雾化器压力 45 psi APCI 加热器 350℃ APCI喷雾针，正离子模式 4pA 正离子化的毛细管电压 3000V 质量数范围 70-170m/z 分析物的 MS 化合物信息 表 3. Agilent 6546 LC/Q-TOF 的详细MS 设置 时间段 开始时间(min) 质量数范围(m/z) 采集速率 (质谱图/秒) 碎裂电压(V) 1 0 70-170 1.5 120 2 1.6 70-170 1.5 90 3 2.8 70-170 2 120 校准浓度范围为 0.05-100 ng/mL(表4)。所有分析物的R²值均大于0.996，在整个浓度范围内表现出线性响应。图1显示了所有测试的亚硝胺化合物在 10 ng/mL 下的代表性叠加提取离子色谱图。 表 4. Agilent 6546 LC/Q-TOF 的结果汇总。数据包括信噪比(S/N)、计算得到的 LOQ、回归系数、校准曲线拟合结果和线性范围。所有标准品均采用线性函数和1/x加权的校准曲线 化合物 检测限 (ng/mL) 检测限 (S/N) LOQ (ng/mL) LOQ(S/N) R² 校准曲线 线性范围(ng/mL) NDMA 0.1 16.54 0.25 35.72 0.999 线性 0.1-100 NDEA 0.05 29.56 0.1 79.2 0.999 线性 0.1-100 NMBA 0.25 12.16 0.5 27.88 0.996 线性 0.5-100 NEIPA 0.1 11.22 0.25 80.6 0.998 线性 0.1-100 NDIPA 0.075 16.65 0.15 21.99 0.999 线性 0.075-100 NDBA 0.1 44.60 0.25 61.56 0.997 线性 0.1-100 NMEA 0.05 18.42 0.1 23 0.998 线性 0.05-100 NPyR 0.1 29.73 0.15 50.39 0.999 线性 0.1-100 NPIP 0.075 12.18 0.1 25.30 0.998 线性 0.075-100 NMPhA 0.25 24.22 0.5 32.30 0.997 线性 0.5-100 NMIPA 0.075 29.79 0.1 47.46 0.997 线性 0.075-100 ×101 图1.代表性叠加提取离子色谱图，展示了11种亚硝胺化合物的洗先情况 准确度和重现性 11种化合物中，每种化合物的校准曲线在各个校准浓度下均表现出预期浓度±20%以内的准确度，并且所有浓度下均表现出 CV小于15%的重现性(图4)。表5详细比较了不同浓度下的准确度和重现性。 Compound Name Fommula Mass Anion Cation RT(min) CAS N-Nitrosodimethylamine(NDMA) C2H6N20 74.04801 1.131 62-72-9 N-Nitrosoethylmethylamine(NMEA) C3H8N20 88.06366 2.075 10595-95-6 N-Nitrosopyrrolidine(NPyR) C4H8N20 100.06366 2.222 930-55-2 N-Nitrosodiethylamine(NDEA) C4H10N20 102.07931 3.426 55-18-5 N-Isopropylmethyl nitrosamine(NMIPA) C4H10N20 102.07931 口 3.297 30553-08-5 N-Nitrosopiperdine(NPIP) C5H10N20 114.07931 回 3.766 100-75-4 N-Ethyl-N-Nitroso-2-propanamine(NEIPA) C5H12N20 116.09496 回 4.289 16339-04-1 N-Nitrosodiisopropylamine(NDIPA) C6H14N20 130.11061 4.886 601-77-4 N-methyl-n-nitrosoaniline(NMPhA) C7H8N20 136.06366 回 5.009 614-00-6 N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyricacid(NMBA) C5H10N203 146.06914 2.219 61445-55-4 N-Nitrosodibutylamine(NDBA) C8H18N20 158.14191 6.059 924-16-3 图2.使用 PCDL 通过分子式查找算法进行鉴定和定量 Name Transition N-Nitrosodimethylamine(NDMA) 75.0552 N-Nitrosoethylmethylamine(NMEA) 89.0709 N-Nitrosopyrrolidine(NPyR) 101.0710 N-Nitrosodiethylamine(NDEA) 103.0866 N-Isopropylmethyl nitrosamine(NMIPA) 103.0866 N-Nitrosopiperidine(NPIP) 115.0866 N-Ethyl-N-Nitroso-2-propanamine(NEIPA) 117.1022 N-Nitrosodiisopropylamine(NDIPA) 131.1179 N-methyl-n-nitrosoaniline(NMPhA) 137.0709 N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyricacid(NMBA) 147.0766 N-Nitrosodibutylamine(NDBA) 159.1492 图4.分散在整个色谱图中的代表性化合物校准曲线。所有校准曲线均采用线性函数和1/x的加权因子 浓度(ng/mL) NDMA NDEA NMBA NDIPA NDBA NMEA 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 0.1 86.67 5.57 83.53 1.59 不适用 不适用 91.30 0.55 101.03 6.19 93.93 1.67 0.25 87.00 3.96 88.33 2.58 不适用 不适用 91.33 4.67 95.13 5.69 89.40 4.55 0.5 97.23 4.51 101.17 3.62 92.40 1.96 94.6 2.27 102.30 3.38 102.53 3.28 1.0 104.93 2.44 110.80 2.47 98.37 5.80 109.83 2.13 101.80 1.15 103.23 0.78 Agilent 6546 LC/Q-TOF高分辨率LC/MS/MS 可以在低浓度水平下分析亚硝胺杂质，高分辨率质谱能够可靠地检测药品中存在的亚硝胺化合物。本应用简报证明了 6546 LC/Q-TOF 仪器在检测这些低浓度亚硝胺杂质方面的灵敏度。此方法可用于定量分析不同 ARB 药品中的这些杂质，并能根据药品的洗脱模式改变色谱条件，确保可以将药物峰转移到废液中，以避免质谱仪污染。 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) 1. USFDA guidance document：Development and validation ofa RapidFire-MS/MS method forscreening of nitrosamine impurities ( 2. USFDA guidance document： Liquidchromatography-high resolutionmass spectrometry (LC/HRMS) method for the d etermination of Six nitrosamine impurities in ARB drugs ) 致谢 我们衷心感谢 PS3 Labs LLP， Hyderabad，TS， India 为我们提供亚硝胺标准品。 Agilent 6546 LC/Q-TOF  高分辨率LC/MS/MS 可以在低浓度水平下分析亚硝胺杂质，高分辨率质谱能够可靠地检测药品中存在的亚硝胺化合物。本应用简报证明了 6546 LC/Q-TOF 仪器在检测这些低浓度亚硝胺杂质方面的灵敏度。此方法可用于定量分析不同 ARB 药品中的这些杂质，并能根据药品的洗脱模式改变色谱条件，确保可以将药物峰转移到废液中，以避免质谱仪污染。