中药材中30种禁用农药及代谢物残留检测方案(液质联用仪)

LC-MS/MS法测定中药材中30种禁用农药及代谢物残留含量 应用中心 前言 国家药典委员会如今陆续公布了修订的《0212药材和饮片检测通则》、《2341农药残留测定法》和其新增的“第五法药材及饮片(植物类)中禁用农药多残留测定法”。在此次的公示稿中，最重要的变化是增加了33种禁用农药的清单列表，并在“第五法”中明确了其检测方法。在这33种禁用农药中有30种可采用LC-MS/MS平台为分析手段。本文文照《2341农药残留量测定法》征求意见稿中第五法的仪器参数、30种农药的推荐离子对和色谱条件、并依照第五法的样品前处理方式，建立了中药材中30种禁限用农药及代谢物残留量测定的方法。该方法灵敏度高，重复性好，完全满足2020版《中国药典》对药材及饮片(植物类)中30种禁用农药限量值的要求。 实验部分 标准品和试剂：30种农药混标 (CDAA-M-490361-JZ-2ml)；甲醇和乙腈为色谱级，室温保存；甲酸和乙酸为LC-MS级，纯度98%，室温保存；甲酸铵为LC-MS级，纯度97%，室温保存。 仪器：超高效液相色谱仪(具体配有二元超高压输液泵、超高压自动进样器(含冷却功能)、柱温箱)与三重四极杆质谱仪EXPEC-5210联用系统。 图1EXPEC-5210三重四级杆串联质谱仪 杭州谱育科技发展有限公司 液相色谱条件： 色谱柱： CNWShell C18液相核壳色谱柱(2.1x100mm 2.6um)流动相：A相0.1%甲酸溶液(含5mmol/L甲酸铵)；B相乙腈-0.1%甲酸溶液(含5mmol/L甲酸铵)(95：5) 流速：0.3mL/min；主温：40℃ 洗脱方式：采用梯度洗脱，时间程序见表1。 表1梯度洗脱条件 时间 (min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 70 30 1 70 30 12 0 100 14 0 100 14.1 70 30 15 70 30 质谱条件： 离子源为电喷雾(ESI)离子源，正离子扫描模式。监测模式为多反应监测(MRM)，各化合物监测离子对、碰撞电压(CE)等参数见表2。为提高检测灵敏度，可根据保留时间分段监测各农药。 表2各化合物监测离子对及参数 编号 化合物 监测离子对 锥孔电压(DP) 碰撞能量 (CE) 1 甲胺磷 142.1>125.0 30 142.1>94.1 2 涕灭威亚砜 207.1>89 35 207.1>132 3 久效磷 224.0>193.0 32 224.0>127.0 4 涕灭威砜 240.0>223.0 35 240.0>86.0 样品制备 供试品溶液：取黄芪药材粉末(过三号筛)3g，精密称定，置50ml聚苯Z烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15ml，涡旋使药粉充分浸润，放置30分钟，精密加入乙腈15ml，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡(500次/min) 5分钟，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末(4：1)7.5g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡(500次/min)3分钟，于冰浴中冷却10分钟，离心(4000转/min)5分钟， 取上清液9ml， 置预先装有净化材料的分散固相萃取净化管[无水硫酸镁900mg， N-丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷键合硅胶300mg，硅胶300mg，石墨化碳黑90mg]中，涡旋使充分混匀，置振荡器上剧烈振荡(500次/min) 5分钟使净化完全，离心(每分钟4000转)5分钟，精密吸取上清液，置氮吹仪上于40°℃水浴浓缩至约0.4ml， 加乙腈稀释至1.0ml，涡旋混匀，滤过，取续滤液，即得。 线性范围与检出限 标准曲线溶液：30种农药混标用乙腈稀释标准曲线浓度为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的各标曲溶液，注入液相色谱质谱联用仪。涕灭威、涕灭威亚砜在浓度1-100ng/ml范围内线性相关，甲基异柳磷、内吸磷、地虫硫磷、甲拌磷砜、水胺硫磷在浓度0.5-100ng/mL范围内线性相关，其他农药在浓度0.2-100ng/ml范围内线性相关，相关系数均大于0.99。将标准曲线的低浓度点溶液分别注入液相色谱质谱联用仪，根据各峰信号强度，计算其检出限。结果标明，30种农药的检出限均能满足检测要求。 精密度 取混合对照品溶液(甲胺磷，克克威，3-羟基克百威，胺苯磺隆，甲磺隆，氯磺隆，蝇毒磷，磷胺，涕灭威，涕灭威砜，涕灭威亚砜，水胺硫磷浓度为 5ng/ml；硫环磷，久效磷浓度为3ng/ml；氯唑磷浓度为1ng/ml， 其余化合物浓度为2ng/ml)，注入液相色谱质谱联用仪，连进6针， 计算峰面积RSD。结果见表3，色谱图见图2。 加标回收率 在供试品溶液中分别加入混合对照品(涕灭威、涕灭威亚砜、甲基异柳磷、、内吸磷、地虫硫磷、甲拌磷砜、水胺硫磷加标量为5ug/kg；其余化合物加标量为2ug/kg)各3份，按照方法进行测定，结果见表4。 图230种农药MRM谱图 表3精密度试验结果 (n=6) 化合物 RSD (%) 序号 化合物 RSD (%) 甲胺磷 1.18 16 胺苯磺隆 3.14 2 涕灭威亚砜 2.29 17 内吸磷 3.25 3 久效磷 2.89 18 特丁硫磷亚砜 3.40 涕灭威砜 3.91 19 甲拌磷砜 5.21 5 杀虫脒 2.72 20 水胺硫磷 3.59 6 3-羟基克百威 3.40 21 苯线磷 4.62 7 硫环磷 4.49 灭线磷 3.11 8 苯线磷亚砜 2.24 特丁硫磷砜 2.12 9 磷胺 1.23 24 氯唑磷 2.98 10 涕灭威 4.93 硫线磷 3.75 11 苯线磷砜 2.66 甲基异柳磷 4.54 12 甲磺隆 3.14 27 蝇毒磷 5.77 13 克百威 3.35 28 地虫硫磷 4.22 14 氯磺隆 2.58 29 治螟磷 3.09 15 甲拌磷亚砜 3.12 30 甲拌磷 4.03 应用简报：编号： 表4回收率试验结果 LC-MSMS 2019-008 序号 化合物 平均回收率(%) 序号 化合物 平均回收率(%) 1 甲胺磷 88.26 16 胺苯磺隆 92.28 2 涕灭威亚砜 90.12 17 内吸磷 95.54 3 久效磷 81.32 18 特丁硫磷亚砜 104.12 4 涕灭威砜 92.67 19 甲拌磷砜 117.22 5 杀虫脒 88.33 20 水胺硫磷 80.56 6 3-羟基克百威 95.34 21 苯线磷 99.12 7 硫环磷 95.12 22 灭线磷 96.75 8 苯线磷亚砜 86.33 23 特丁硫磷砜 102.22 9 磷胺 89.22 24 氯唑磷 108.12 10 涕灭威 83.31 25 硫线磷 98.22 11 苯线磷砜 86.21 26 甲基异柳磷 71.12 12 甲磺隆 93.07 27 蝇毒磷 90.87 13 克百威 88.76 28 地虫硫磷 89.98 14 氯磺隆 92.33 29 治螟磷 72.12 15 甲拌磷亚砜 89.44 30 甲拌磷 96.33 结果与讨论 药材样品经过QuEChERs法处理后，可在14min内快速、准确对其中的30种农药进行筛查测定。本文考察了方法的线性、精密度、回收率等，结果表明：30种农药在检测范围内线性良好，相关系数均大于0.99；方法精密度在5.77%以内，大部分化合物回收率均在70%~120%范围内。方法灵敏度满足新药典规定的“不得检出”的定量限需求。使用高灵敏、高抗污染能力的EXPEC5210系统，可以对中药材及饮片中30种农残进行灵敏、准确的定量检测。 EXPEC TECHNOLOGY 本方案参照《2341农药残留量 测定法》征求意见稿中第五法的仪器参数、30 种农药的推荐离子对和色谱条件、并依照第五法的样品前处理方式，建立了中药材中30种禁 限用农药及代谢物残留量测定的方法。该方法 灵敏度高，重复性好，完全满足2020版《中国药典》对药材及饮片(植物类)中30种禁用农药限 量值的要求。