金银花中33种禁用农药及其单体残留量检测方案(浓缩仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2020-C004 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 金银花中33种禁用农药及其单体残留量的测定 中国药典；高效液相色谱-串联质谱；气相色谱-串联质谱；农药残留；固相萃取 介绍 金银花是我国传统的药食两用中药材之一，具有清热解毒、疏风散热的功效，应用领域广泛，市场需求量大。金银花在种植过程中易染病虫害，化学农药是其防治的最主要手段。因此金银花的农药残留问题也越发引起人们的关注。由于金银花中含有挥发油、绿原酸、色素等成分，提取液不宜直接上机测试，需要经过一定的净化。 本文参照2020版《中国药典》2341通则农药残留量测定法新增第五法《药材及饮片(植物类)中禁用农药多残留测定法》中的固相萃取法，使用乙腈对金银花试样进行均质提取，经盐析和离心后， GC-MS/MS组化合物采用GCB/NH，柱净化，LC-MS/MS组化合物采用HLB柱净化，最后上机检测。本方法采用睿科AH-30全自动均质器进行批量提取，提取液经睿科MPE高通量真空平行浓缩仪进行浓缩，然后用Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪对提取液进行净化，最后再用MPE高通量真空平行浓缩仪对洗脱液进行浓缩，实现了金银花前处理过程全流程自动化。在40 ug/kg的加标水平下GC-MS/MS法中33种化合物的回收率在71.5-118.4%之间， RSD值小于10%；在20 ug/kg的加标水平下LC-MS/MS法中30种化合物的回收率在72.1-120.5%之间， RSD值小于10%，满足实验要求。 仪器 Raykol AH-30全自动均质器 取仪 Raykol MPE-16 高通量真空平行浓缩仪 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃试剂 乙腈： HPLC级，甲苯： HPLC级 GC-MS/MS法33种农药混合标准储备液：：440pg/mL LC-MS/MS法30种农药混合标准储备液：20ug/mL 2. 样品前处理 准确称取5g试样(精确至0.01g)于 100 mL离心管中，加入1g氯化钠后立即摇散，加入50mL乙腈，用Raykol AH-30全自动均质器在12000r/min的搅拌速度下均质2 min， 转速4000r/min 下离心5 min， 均质条件如图1所示。将上清液倒入浓缩杯中，残渣再加入50 mL乙腈，继续均质1 min，离心5 min， 合并两次提取液，在Raykol MPE-16高通量真空平行浓缩仪中浓缩至3~5mL，放冷的样液转移至10 mL 容量瓶中，用乙腈多次润洗浓缩杯并转移至容量瓶中，最终用乙腈定容至刻度。 GC-MS/MS法：量取上述溶液 2mL 至 15mL上样管中，以石墨化碳氨基复合固相萃取小柱(500mg，6ml)为净化柱，先用10 mL乙腈-甲苯(3：1)活 图-1金银花样品的均质条件 Agilent 1290+6470高效液相色谱/质谱联用仪Agilent 8890+7000D气相色谱/质谱联用仪 GC-MS/MS 法内标使用液：磷酸三苯酯0.ug/mL GCB/NH，柱 (RayCure， 500 mg/500 mg/6 mL，RC-204-13822) HLB 柱(RayCure， 200 mg/6 mL， RC-204-36476) 化小柱，弃去流出液，之后以1 mL/min 的速度上样，再用2×3mL的乙腈-甲苯(3：1)清洗样品瓶并过柱，最后用14 mL的乙腈-甲苯(3：1)洗脱，收集以上流出液，具体的固相萃取条件如图3所示。用 MPE 将洗脱液浓缩至近干，用乙腈转移并稀释至2mL，混匀。精确移取1mL上述定容液，精密加入0.3mL 磷酸三苯酯内标溶液，过0.22 Ium滤膜后上气相色谱/串联质谱仪测定。 LC-MS/MS法：量取直接提取法制备的溶液3mL，通过 HLB柱净化，收集全部流出液，混匀。精确移取1mL上述净化液，精密加入0.3 mL 水后过0.22um滤膜，上高效液相色谱/串联质谱仪测定。 图-2金银花样品的浓缩条件 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间(min) 1 填充样品路径 C2H3N+C7H8... 5 3 2.9 2 清洗样品通道 C2H3N+C7H8... 2.8 3 活化 C2H3N+C7H8..， 有机废液 5 10 2.6 4 上样 收集 1 3 3.5 5 清洗样品瓶 C2H3N+C7H8... 收集 50 3 3.8 6 清洗样品瓶 C2H3N+C7H8... 收集 50 3 3.8 7 洗脱 C2H3N+C7H8... 收集 3 14 5.3 8 气推 收集 20 5 0.8 9 结束 10 图-3 Fotector Plus 对金银花中多农残的固相萃取条件 气相色谱质谱联用条件 采用 SCAN 全扫描模式进行定性分析， MRM多反应检测模式进行定量分析。 GC-MS/MS 检测条件：进样口温度280℃，不分流进样，隔垫吹扫流量为3 mL/min，进样量1.0uL；载气为高纯He气，恒流模式，流速为 1.0mL/min；电子轰击电离源(EI)，离子源温度280℃， 传输线温度280℃。色谱柱为 Agilent CP9151VF-1701MS((30 m x250umx 0.25um)。 GC 程序升温程序：初始温度40℃，保持1 min；以40C/min 速度升温至120℃；以5℃/min升温至240℃，以12℃/min升温至300℃，保持4min。 MRM 参数 表-1各农药的保留时间、监测离子对及碰撞电压 编号 名称 保留时间 (min) 母离子(m/z) 子离子(m/z) CE (V) 1 灭线磷 15.99 199.7 157.8 5.0 199.7 114.0 5.0 157.8 96.7 20.0 157.8 113.8 15.0 2 杀虫脒 16.51 152.0 117.0 15.0 196.0 181.0 5.0 260.0 75.0 5.0 3 甲拌磷 17.01 230.8 175.0 10.0 230.8 128.6 25.0 4 a -BHC 17.64 181.0 145.0 15.0 Y-BHC 19.29 218.7 182.9 5.0 B-BHC 22.34 218.9 147.0 10.0 8-BHC 23.21 218.9 111.0 10.0 5 氟虫腈 29.29 367.0 213.0 35 367.0 255.0 25 367.0 332.0 15 351.0 255.0 20 气质联用色谱图 图-433种禁用农药标准品的总离子流图(1pg/mL) 高效液相色谱质谱联用条件 柱子 ACQUITY UPLC BEH C18 (100mm ×2.1mm×1.7um) 流速 0.30 mL/min 流动相 A： 5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)，B：乙腈 柱温 35℃ 进样量 2juL 检测器 Agilent 6470 离子模式 ESI 吹扫气 8L/min 氮气温度 330℃ 簇电压 3500 雾化压力 45 psi 梯度洗脱 0.0-4.0 min，5-15%流动相B； 4.0-14.0 min， 15-100%流动相B；14.0-15.0 min， 100-5%流动相B； 15.0-17.0 min， 5-5%流动相B. MRM 参数 表-2各农药的保留时间、监测离子对及碰撞电压 编号 名称 保留时间1((min) 母离子(m/z) 子离子(m/z) CE (V) 1 涕灭威亚砜 2.93 207.1 132.4 5 207.1 89.2 13 2 涕灭威砜 3.90 240.0 223.0 5 240.0 86.0 21 3 久效磷 4.58 224.1 193.1 5 224.1 127.1 13 4 杀虫脒 6.01 197.2 152.1 21 197.2 117.2 33 197.2 46.2 25 243.2 97.0 37 22 特丁硫磷砜 10.68 321.1 171.2 9 321.1 97.0 53 23 氯唑磷 11.34 314.0 162.3 17 314.0 120.2 29 24 硫线磷 11.81 271.1 159.2 13 271.1 131.1 25 271.1 97.1 45 25 蝇毒磷 11.81 363.0 307.1 17 363.0 227.2 29 26 甲基异柳磷 11.85 332.2 273.1 5 332.2 231.2 21 27 地虫硫磷 11.95 247.0 137.1 9 247.0 109.1 17 28 治螟磷 11.99 323.0 171.2 13 323.0 115.0 33 323.0 97.1 53 29 甲拌磷 12.08 260.9 75.1 260.9 47.0 45 30 甲胺磷 14.25 142.1 125.1 9 142.1 94.1 37 液质联用色谱图 图-530种禁用农药标准品的总离子流图(1ug/mL) 4.样品测试 基质加标回收实验 在金银花样品中添加浓度为40) ug/kg 的33种农药(GC-MS/MS) 和20ug/kg 的30种农药(LC-MS/MS) 进行加标回收验证，使用上述样品前 处理方法，最后分别经 GC-MS/MS 和 LC-MS/MS检测，平均回收率和 RSD 结果如下所示。 表-3 GC-MS/MS 法33种化合物的平均回收率和相对标准偏差(n=3) 蝇毒磷 77.0 71.8 81.8 76.9 6.5 表-4 LC-MS/MS 法30种化合物的平均回收率和相对标准偏差(n=3) 治螟磷 85.7 84.8 89.6 86.7 2.9 5.总结 分取上清液时为防止下层残渣倒入浓缩杯中，可在浓缩杯上放置漏斗和滤纸，将上清液过滤于杯中，并用乙腈洗涤滤纸。 在减压浓缩过程中需控制好温度和压力以防止部分化合物分解和损失，温度不能超过40°C，压力不要低于80 mbar。 LC-MS/MS法需取1mL提取液并加0.3ml水，注意先不要将1mL提取液装进2mL 色谱瓶中，因为提取液加了水之后会变浑浊需要过膜导致操作不便。可将1 mL提取液转移到子弹头离心管中再 AH-30全自动均质器可自动进行试样均质和刀头清洗，无需人员值守，避免有机溶剂毒害，操作简单、便捷，为批量样品的均质提供帮助。 MPE-16高通量真空平行浓缩仪采用数字型的真空控制系统，能精确、实时地检测真空度，避免样液中目标物在过低真空度下损失，同时采用水浴加热和平稳的圆周震荡模式，保证样品的平行性和可靠性，16个大体积提取液同时浓缩，可实现批量、快速、高效的浓缩过程。 睿科 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取 加入0.3mL水，混匀后再过滤到2mL色谱瓶中。 浓缩洗脱液时不可浓缩至干也不可残留过多洗脱液，至干会严重影响回收率，而残留过多甲苯则会在检测时产生溶剂效应。 用 GCB/NH， 净化时可适当增加乙腈-甲苯(3：1)的洗脱量。 由于 GCB/NH，复合柱中的 NH对酸性除草剂(甲磺隆、氯磺隆和胺苯磺隆)具有很强的吸附作用，磺酰脲类除草剂的回收率非常低，因此 LC-MS/MS法建议用 HLB 柱净化。 仪在对金银花中多农残进行固相萃取净化时，使用高精度注射器和十二通阀切换等动作，实现了活化、上样、淋洗、洗脱整个固相萃取过程的全自动化，6通道同时运行，8种溶剂可选，3种排废可选，还带有自动清洗样品瓶的功能来防止目标化合物在瓶壁上的残留，实现全自动化过程的同时保证了回收率。采用该仪器进行固相萃取避免了手动固相萃取人为值守、流速不可控、耗时耗力和平行性差等缺点，并且减少了实验人员与甲苯这类有毒有害溶剂的接触时间，保护实验人员的健康安全。 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知 ◎睿科集团股份有限公司 2020年7月版 网址：www.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 金银花是我国传统的药食两用中药材之一，具有清热解毒、疏风散热的功效，应用领域广泛，市场需求量大。金银花在种植过程中易染病虫害，化学农药是其防治的最主要手段。因此金银花的农药残留问题也越发引起人们的关注。由于金银花中含有挥发油、绿原酸、色素等成分，提取液不宜直接上机测试，需要经过一定的净化。本文参照2020版《中国药典》2341通则农药残留量测定法新增第五法《药材及饮片（植物类）中禁用农药多残留测定法》中的固相萃取法，使用乙腈对金银花试样进行均质提取，经盐析和离心后，GC-MS/MS组化合物采用GCB/NH2柱净化，LC-MS/MS组化合物采用HLB柱净化，最后上机检测。本方法采用睿科AH-30均质器进行批量提取，提取液经MPE高通量真空平行浓缩仪进行浓缩，然后用Fotector Plus全自动固相萃取仪对提取液进行净化，最后再用MPE高通量真空平行浓缩仪对洗脱液进行浓缩，实现了金银花前处理过程全流程自动化。在40 ug/kg的加标水平下GC-MS/MS法中33种化合物的回收率在71.5-118.4%之间，RSD值小于10%；在20 ug/kg的加标水平下LC-MS/MS法中30种化合物的回收率在72.1-120.5%之间，RSD值小于10%，满足实验要求。