PCR 扩增线粒体 DNA中片段的大小和浓度检测方案(生物芯片)

用Agilent 2100生物分析仪和DNA 500LabChip分析PCR扩增的线粒体DNA 应用 国土安全/法医 作者 Mark Jensen 安捷伦科技公司2850 Centerville RoadWilmington， DE 19808-1610USA 摘要 PCR扩曾线粒体DNA(mtDNA)的序列分析正速成为法医测试中公认的手段。法医mtDNA应用关键性的第一步，是确定这些扩增产物片段大小、纯度和浓度是否适合序列分析。Agilent2100生物分析仪和DNA 500 LabChip能够准确而精密地测定DNA片段的大小和浓度。在这篇应用报告中，用生物分析仪在序列测定前快速而有效地分析了PCR扩增的DNA片段。 前言 近年来mtDNA序列分析的应用正在迅猛增长。1995年美国国防部认定mtDNA分析可以作为一种可靠的法医工具[1]。从那时起，美国战争伤亡人员的鉴定开始使用mtDNA序列分析。911世贸大厦遇难者的遗体也正在用mtDNA序列测定的方法进行分析。除了这些法医应用以外， mtDNA还被用于历史和人类学样品的研究。 这些研究包括这样一些样品，路易17的心脏[2]、沙皇尼古拉二世的遗骸[3]、7000年前的脑组织，以及穴居人的遗骨等。 线粒体是所有真核细胞胞质中存在的亚细胞结构。其结构是由原始真核细胞结合了细菌细胞派生而来的。细菌细胞经过一段时间后与其宿主形成了一种共生关系，最终成为其宿主基本生化结构的一部分。这就是为什么线粒体包含了自己独特的DNA，编码了这些结构中存在的一些蛋白质。 1981年Fredrick Sanger的实验室首次测定了线粒体DNA的序列。人类mtDNA是一个含有16569个碱基对(bp)的小型环状基因组。目前人类mtDNA的参考序列是安德森或剑桥参考序列(CRS)(Genebank accession：M63933)。这一基因组编码了无数参与氧化磷酸化的多肽(蛋白质的亚单位)。这一基因组中还发现了2个核糖体RNA和22个反转录RNA的核苷序列。除了这些编码序列以外，线粒体基因组还包含了一个1100 bp的非编码区域，称为D-loop或控制区。D-loop包含了对人类鉴定有用的序列变异。不相关个体之间这一区域的序列变异为1%-3%。大多数序列变异都发生在控制区的两个部分，超变异区1(HV1)和超变异区2(HV2)。 线粒体DNA序列直接从母体遗传。除非发生突变，否则兄弟姐妹和所有母系亲属都拥有相同的mtDNA。由于mtDNA不会经过重组，所以母系亲属上溯几代都能提供有用的基因样品。这些序列信息在人员失踪案件中常常相当有用。在法医案例中，mtDNA序列更常用的是排除而不是确定犯罪嫌疑人，因为同一家族中的许多人都拥有相同的mtDNA序列。 细胞核只有一个拷贝的基因组DNA，而细胞质中可能有1000多拷贝的mtDNA。由于每个细胞都含有多个mtDNA拷贝，所以只需要几个细胞就能进行序列分析。要进行mtDNA样品的序列分析，通常需要提取DNA，并用聚合酶链反应(PCR)扩增变异区域。因为扩增能把目标DNA的几个拷贝转变成几亿个拷贝，所以有限的或腐败很严重的样品也能进行序列分析，例如骨头、牙齿或头发。 PCR扩增mtDNA的分析 扩增mtDNA HV区的PCR次数取决于样品的年代和条件。如果mtDNA降解极少，每个HV区只需要进行一次PCR。反应产物大约450bp长。长期暴露在潮湿、高温和细菌条件下， DNA将发生明显降解，因此断裂成较小的碎片。降解样品中mtDNA的平均片段长度可能比450 bp小得多。由于扩增产物的大小不能超过初始的目标DNA，所以对严重降解样品的扩增需要进行一系列较短的PCR步骤，通常在100-200 bp片段长度。 PCR产物的分析一般使用琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳。用户需要在未知PCR样品的旁边加一组已知浓度的预定标准。用户可将PCR样品条带的强度与其中的 一个标准进行比对。标准的浓度范围通常至少要覆盖三个数量级，因为也有必要对未预料到的任何第二种PCR产物进行定量。这类分析的准确度很低，因为浓度的估算误差经常会超过100%。由于这一原因，目标与非目标PCR产物比例的计算也存在相当的问题。 Agilent 2100生物分析仪是第一台可用于核酸分离的芯片类商品系统，它可以克服凝胶电泳的局限性。Agilent 2100生物分析仪在微型通道中对核酸片段进行分离，并进行自动检测，以及在线数据处理。 Agilent2100生物分析仪连接在一台PC机上，以进行运行控制和自动数据分析。 用Agilent 2100生物分析仪分析PCR产物，与经典的凝胶电泳相比，有几个重要的优点。由于使用了短分离通道和高电场，与凝胶电泳相比，显著提高了分析速度。仪器装配了荧光检测系统，因而带来了卓越的检测灵敏度。预包装的试剂和工具包，与标准化的操作方案，使数据的重复性更好。这些工具包还有助于提高不同运行批次、不同芯片和仪器之间的重复性。与凝胶扫描系统的数据处理方式相比，手工定量的成分明显减少，数据分析都是以自动方式进行的。样品和试剂消耗降低到1至几微升，最大限度地减少了与有害物质的接触，降低了废弃物的量。 有几种试剂盒可用于各种核酸样品的分析。DNA 500LabChip@的片段范围是25-500 bp， 正好适合mtDNA序列分析所需的扩增浓度和质量的快速测定。DNA500分析方法对25到100 bp的片段分辨率是5-bp，对100到500 bp片段分辨率为5%。在整个片段长度范围内，长度准确度误差低于10%。以前的研究表明，生物分析仪能够检测琼脂糖凝胶电泳无法鉴定的DNA片段。 与凝胶电泳用SYBR gold或溴化乙锭染色相比，生物分析仪的检测灵敏度比SYBR gold染色高5倍，比溴化乙锭染色高25倍。生物分析仪能检测到20 pg水平的DNA[4]。 段浓度的测定误差均小于10%，变异系数小于15%[5]。 PCR扩增mtDNA的要求 生物分析仪的定量能力见表1。用含有100、200、400 bp三个片段的DNA质量阶梯对定量准确度进行验证。阶梯各组分的浓度由供给商提供(Low DNAMass "Mladder， Life Technologies， USA)。所有三个片 表1. Agilent 2100生物分析仪的定量准确度和精密度 高质量的序列数据需要浓度范围在10-100 ng/mL的均一PCR产物。FBI地方实验室的实验室规程规定，扩增的目标mtDNA必须比其它未知PCR产物的浓度高10倍。不符合纯度要求将导致第二种PCR产物的序列干扰目标序列测定，甚至出现核苷碱基的误识别。基于以上原因，对所有PCR产物浓度的准确测定是评定PCR样品质量的关键。 100 bp 200 bp 400 bp 平均[ng/pL] 0.73 1.53 3.02 目标值[ng/pL] 0.80 1.60 3.20 误差百分比 -8.28 -4.56 -5.62 STDV 0.08 0.11 0.20 CV 10.73 7.46 6.73 图1显示了HVI区mtDNA序列扩增的实例。引物二聚体小峰旁边相邻的是低分子量标记物峰， PCR产物只有均一的273 bp PCR产物，浓度为44.1 ng/uL。这样的产物完全适合进行mtDNA序列分析。 图1. Agilent 2100生物分析仪上得到的HVI区PCR扩增mtDNA的电泳图 图2显示的mtDNA扩增产物包含第二种PCR扩增污染物。目标PCR产物为222 bp的片段，浓度为48.8 ng/uL。未知的第二种产物是浓度为10.2 ng/uL的69 bp片段。由于第二种产物的浓度比目标片段高出10%，所以根据目前FBI 10：1的规定，这次PCR扩增不适合进行mtDNA测序。 MtDNA序列扩增的另一个常见问题，发生在腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)含量丰富，又接着是一长串鸟票呤的区域。扩增这种序列时， DNA可能部分解链，然后退火。含有许多G的长链退火后有时可能会丢失自己的参照系，多结合一个G。如果这种情况在扩增过程中多次发生，就可能出现一定浓度含n+1或n+2个G的扩增产物。这种现象称为G-stutter。当出现这种G-stutter现象的PCR产物用于测序反应时，来自G的下游数据通常无法解释。 图2. 用Agilent 2100生物分析仪分析HV1区PCR扩增的mtDNA电泳图显示，存在第二种未知的PCR产物。 图3A显示了出现G-stutter的PCR扩增HV1电泳图。对这个PCR产物序列进行荧光标记，存在混合序列，其中有包含n、n+1、n+2G的各种片段。这种G区混合序列的下游数据实际上根本无法解析。图3B显示了序列数据混乱的一个例子。核苷碱基N表明没有得到序列信息。 图3A. 用Agilent 2100生物分析仪分析HVI区mtDNA PCR扩增电泳图显示，存在多个G-stutter产物。 CATGGGGGGGGGGGTTTTANNTGNATNNGGTT 图3B. 有G-stutter 的mtDNA PCR扩增产物得到的典型测序数据。注意，在几个G之后，序列不可读。 图4A显示的是不含干扰物的同一HVI序列的PCR扩增电泳图。这次PCR扩增只有一种均一的产物，非常适合进行DNA序列分析。图4B显示了一部分从这种PCR产物得到的序列数据。请注意，和图3B中序列不同，来自一连串G的序列清晰、明确。 图4A. HVI区PCR扩增的mtDNA Agilent 2100生物分析仪电泳图显示，只有一种均一的PCR产物。 CATGGGGAGGGGGTTTTGATGTGGATTGGGTT 图4B. 均一的mtDNA PCR产物所得到的典型序列数据。注意，序列数据显示一连串G之后序列依然可读。 线粒体DNA分析正在法医界迅速普及以作为证据。Agilent 2100生物分析仪，由于能够快速提供mtDNA扩增产物的片段大小和浓度，而对这一分析技术起到了推动作用。通过使用外标和内标DNA标记物，Agilent 2100生物分析仪实现了PCR产物的准确定量分析和片段大小测定。应用这一技术能够鉴定出扩增mtDNA片段的质量，并对这些片段进行定量测定，以确保接下来的序列分析能有可靠的结果。DNA 500试剂盒能对25到500碱基对的DNA进行分离。因为生物分析仪具有卓越的灵敏度和分辨率，它能够对第二种PCR产物进行分离和准确定量。在用户需要证明其目标mtDNA扩增产物超出其它未知第二种PCR产物10倍以上时，这种功能尤为重要。 ( 参考文献 ) ( 1. B. Budowle， M. Allard， M. Wilson and R. Chakraborty，“Forensics and Mitochondrial DNA：Applications， Debates and Foundations”(2003) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.，4，119-141 . ) ( 2. B. Jehaes， K. Toprak， N. Vanderheyden， H. Pfeiffer，J. Cassiman， B. Brinkmann and R. D ecorte，“ P itfalls in the analysis of mitochondrialDNA from ancient specimens and the consequencesfor forensic a nalysis： the historical case of the puta-tive heart of Louis XVII”(2001) Int. J. Legal Med.， 115， 1 35-141. ) 3.NN. Rudin， and K. Inman，“An Introduction to ForensicDNA Analysis”， CRC Press LLC， New York， 2002，pp. 59-60. 4.D. Vitale，“Comparing the Agilent 2100 Bioanalyzerperformance to traditional DNA analysis techniques”，Agilent Technologies publication 5980-0549Ewww.agilent.com/chem 5.CO. Mueller，“High resolution DNA analysis with theDNA 500 and DNA 1000 LabChip@ kits”， AgilentTechnologies publication 5988-3041Ewww.agilent.com/chem 更多信息 如果需要了解有关我们产品和服务的更多信息，请问我们的网站www.agilent.com/chem。 www.agilent.com/chem 安捷伦对本资料中出现的错误，以及由于提供或使用本资料所造成的有关损失不承担责任。 本资料中所涉及的信息、说明，如有更改，恕不另行通告。 Low DNA MassTM是生命科技公司的商标。LabChip是Caliper科技公司的美国注册商标。 ◎安捷伦科技公司，2004 中国印刷2004年4月14日5989-0985CHCN Agilent Technologies ..Agilent Technologies PCR扩增线粒体DNA(mtDNA)的序列分析正迅速成为法医测试中公认的手段。法医mtDNA应用关键性的第一步，是确定这些扩增产物片段大小、纯度和浓度是否适合序列分析。Agilent 2100生物分析仪和DNA 500 LabChip能够准确而精密地测定 DNA片段的大小和浓度。在这篇应用报告中，用生物分析仪在序列测定前快速而有效地分析了PCR扩增的DNA片段。扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”微信公众号，获取更多解决方案资讯。