尿液中苯甲酰爱康宁检测方案(液相色谱仪)

作者 Irina Dioumaeva， John M. HughesAgilent Technologies， Inc. 应用Agilent Bond Elut Plexa PCX 和AgilentPoroshell 120对尿液中的苯甲爱爱康宁进行SAMHSA标准的LC/MS/MS分析 应用报告 法医与药物测试 摘要 由美国药物滥用与精神健康服务管理局 (SAMHSA) 颁布，于2010年10月生效的新准则，允许在政府认证的药物检测实验室采用 LC/MS/MS 法确认初步药物测试结果。由于LC/MS/MS 法不需要衍生步骤，因此它远比以前应用的 GC/MS 法要简便的多。我们提出了一种满足最新 SAMHSA 准则要求的苯甲酰爱康宁的分析方法，并对其线性、检测限(LOD)、准确度和精密度进行论证，还对该方法的基质效应、萃取回收率和总处理效率进行了考察。这是涵盖所有 SAMHSA 监控药物类别的一系列六种简便检测方法之一，该方法主要使用安捷伦产品进行分析， 包括 Agilent Bond Elut Plexa PCX 混合模式聚合物 SPE 吸附剂， Agilent Poroshell 120 EC-C18，2.7um 表面多孔 LC 色谱柱，Agilent 1200Infinity LC 系统以及采用安捷伦喷射流技术(AJST) 增强电喷雾离子源的 Agilent 6460Triple Quadrupole LC/MS 系统。 苯甲酰爱康宁(BE) 是可卡因存在于尿液中的一种主要代谢产物，可卡因是强烈的具有成瘾性的神经系统兴奋剂和局部麻醉剂。可卡因可在酶催化下水解为苯甲酰爱康宁(发生在肝脏)，也可以不经过酶催化，而在碱性pH条件下生成苯甲酰爱康宁(Anon.， 2011)。苯甲酰爱康宁可在摄入可卡因后的几天内在尿液中检出。在冷冻贮藏的尿样中苯甲酰爱康宁相对稳定，而在较高温度和碱性条件下，它能进一步发生水解。SAMHSA规定苯甲酷爱康宁的最高限量浓度为 100 ng/mL， 其检测限为限量浓度的10%， 即10ng/mL。 由于 Agilent Bond Elut Plexa 吸附剂的独特性质，本文所描述的提取方法实现了对苯甲酰爱康宁萃取的高回收率提取，且重复性好。不像其其聚合物吸附剂， Plexa 颗粒具有无氨基的羟基化表面，避免了蛋白质的结合。从而获得了最小的离子抑制作用和最高的检测灵敏度。高流速和良好重现性的实现，主要得益于 Plexa柱填料的窄粒径分布，并且不存在容易导致堵塞的细颗粒。 采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3 × 50 mm， 2.7 pm 色谱柱是由于其具有较高的载样量和极佳的分离性能。填充表面多孔2.7 um 颗粒的 Poroshell 120色谱能能提供与亚 2 um UHPLC色谱柱类似的柱效，但其背压却减少了约40%。因此，它甚至允许用户在耐压400 bar 的常规液相系统上采用较高的流速来提高分辨率，并同时缩短分析时间和再平衡的时间。 在较小的样品进样体积(2uL)且无样品预富集的条件下，该方法具有极佳的信噪比(样品浓度10 ng/mL 时>400：1，此浓度是SAMHSA 规定限量浓度的10%)，这得益于采用了 AJST 技术的Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS 系统电喷雾离子源增强了检测灵敏度。 安捷伦以前的分析方法(由 Moorman 和 Hughes 开发，2010)采用的是 Agilent 6410 Triple Quadrupole LC/MS 系统和其它的SPE/LC 产品和操作步骤。 实验部分 分析物 药物标准品购自 Cerilliant 公司， 为1 mg/mL(苯甲酰爱康宁)和100 pg/mL(苯甲酰爱康宁-D)的甲醇溶液。 苯甲酰爱康宁 Log P (预测值)-0.73-2.26 图1.苯甲酰爱康宁分析物及其化学结构。log P预测值来自 DrugBank，ChemSpider， PubChem ( 材料与仪器 ) ( SPE ) ( · Agilen t Bond Elut Plexa PCX 小柱30 mg， 3 mL(部件号 12108303) ) · Agilent VacElut 20 多管真空装置(部件号12234100) · Agilent 截止阀(部件号12234520) .Agilent 2 mL自动进样器样品瓶(部件号5182-0716) · Agilent AS 样品瓶螺纹口瓶盖(部件号5182-0717) ( SPE ) ( · Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3×50 mm， 2.7 um 色谱柱(部 件号699975-302) ) ( · Agilent 1260 Infinity LC 系统(G1379B微型脱气机，低延迟体积 配置的1312B二元泵， G1367E 自动进样器， G1330B柱温箱) ) ( MS ) ( ·配有应用 AJST 技术电喷雾离子源的 Agilent 6460A Triple Quadrupole LC/MS 系统 ) 样品制备 MS 条件 预处理 ES 离子源参数 离子检测模式 正离子 往1mL尿液中加入内标，使其浓度为 200 ng/mL； 推荐使用12x75mm玻璃试管。加入1 mL2%甲酸溶液，涡旋，如溶液浑浊则离心。 毛细管电压 3，000 V 干燥气流速 10 L/min 干燥气温度 350 °C 雾化气压力 35 psi 萃取 鞘气流速 12 L/min 鞘气温度 400°C 1.用 0.5 mL甲醇活化 Bond Elut Plexa PCX 小柱，浸润，然后使其自然滴出 喷嘴电压 0V MS参数 2. 上样或加载上清液 扫描类型 MRM 预运行脚本 SCP_MSDiverterValveToWaste() 3. 淋洗1：1mL2%甲酸溶液 {MH_Acq_Scripts.exe} 时间段 #1：1.2 min-切换阀到 MS 4. 淋洗2：1mL甲醇 Delta EMV(+) 200 V 5. 在真空(10-15英寸汞柱)条件下，抽干5-10分钟 6. 用1mL新鲜配制的甲醇：氢氧化铵(100：20)溶液洗脱。先使洗脱液自然滴落至收集小瓶中，然后用低真空(2-3英寸汞柱)抽滤 结果与讨论 7. 氮气吹干 8. 用1mL初始流动相(10%甲醇，90%水，0.1%甲酸)复溶LC/MS/MS LC条件 禁止自动减小延迟体积 在酸性 pH 条件下，苯甲酰爱康宁的叔胺基团质子化，从而分析物可以通过疏水保留与强阳离子交子作用被高效的保留在 PlexaPCX 聚合物吸附剂上。 用100%甲醇淋洗 SPE 小柱能消除大部分的基质干扰，同时不会造成 BE损失。向有机洗脱液中添加一种强碱，目的是破坏分析物和强阳离子交换吸附剂间的离子相互作用。在样品洗脱前，将20% NH，OH溶液加到甲醇中，以提高苯甲酰爱康宁的回收率。 采用Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3 × 50 mm， 2.7 um 色谱柱能实现尿液萃取物中苯甲酰爱康宁的快速分离，并可获得极佳的峰形(如图2所示)。液相色谱分离首先采用低有机溶剂比例(10%)的流动相，从而使尿液中的盐类和其它极性成分在样品运行开始时先被洗脱。每次样品运行开始时先将液流转换使其流至废液(0到1.2分钟)，使离子源污染最小化。在第1.2分钟时切换阀将液流转至质谱检测器后立即开始数据采集。流速0.8 mL/min条件下，可获得较短的分析时间和再平衡时间。 浓度为 10 ng/mL时，色谱峰的信噪比>400：1(如图2，上图所示)。这表明 Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS 系统具有优异的性能，能够可靠地检测远低于 SAMHSA 规定限量浓度的苯甲酰爱康宁(10%). SAMHSA 法规要求分析目标分析物和内标物时必须监测一个定量离子和至少一个定性的离子。目标分析物的第三个转换离子(见表1)信息可提供更高的定性能力。Agilent MassHunterQuantitative 软件可自动计算定性离子比率，并可以标出那些超出可接受范围的离子。 表1. MRM 模式数据采集参数 化合物 母离子 子离子 裂解电压 碰撞能量 290.1 168.1 90 15 290.1 105.1 90 30 BE 290.1 82.1 90 32 BE-Dc 298.2 171.1 90 15 BE-D 298.2 110.1 90 30 图3是五个浓度水平的尿液萃取物中苯甲酰爱康宁标准品的校准曲线。通过向阴性尿液中加入苯甲酰爱康宁标准品，制备浓度分别为10、100、500、1000和4000 ng/mL的 BE系列校准标准溶液。添加加代内标物BE-D， 的浓度为200 ng/mL。线性关系极为优异，线性相关系数R2=0.998 证明本方法在一个较宽的动态浓度范围内具有极佳的线性，符合 SAMHSA 准则的要求。 本方法采用 MRM 扫描模式，设置为常态而非动态检测，因为动态 MRM 模式对单一化合物的检测没有优势。 图2.尿液萃取物中BE (10ng/mL) 和BE-D (200 ng/mL) 的MRM 提取离子色谱图。采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3× 50mm， 2.7 pm 色谱柱。噪声区域以加粗的形式显示 图3.尿液萃取物中苯甲酰爱康宁的校准曲线示例。校准浓度范围10到4000 ng/mL，线性相关系数R2=0.998 方法评价 表2中方法的各项性能指标系根据 Matuszewski等(2003)提出的原则计算得到的，其作为行业标准用于评价LC/MS/MS分析方法已被广泛接受。LC/MS/MS测试的样品及其萃取步骤如下：第一组，将限量浓度水平的 BE 预加到阴性尿液中，然后进行萃取，平行五份，进样分析。第二组，将阴性尿液利用同样方法进行萃取，然后萃取物用初始流动相溶液复溶，之后加入苯甲酰爱康宁至100 ng/mL， 平行五份，进样分析。第三组是直接加标至初始流动相(即复溶溶剂)，使其浓度为100ng/mL的限量浓度(流动相加标)。 处理效率(即绝对回收率)是 SPE 萃取加标的阴性尿液后进样分析，获得的目标分析物的峰面积与其无基质的流动相加标后进样分析获得的相应峰面积的比值。萃取回收率是 SPE 萃取加标的阴性尿液后进样分析，获得的目标分析物的峰面积与经过相同方法萃取阴性尿液后的提取物加标样品进样分析获得的相应峰面积的比值。基质效应是分析 SPE 萃取阴性尿液后的提取物加标样品，获得的目标分析物的峰面积与其流动相加标后分析获得的相应峰面积的比值。 准确度是通过校准曲线计算的分析物检测浓度与添加了已知量目标分析物样品的预期浓度的比值。精密度或变异系数(CV)用来衡量重复性，系采用五个测量值的平均值计算其百分标准偏差获得。 表2数据表明本方法分析苯甲酰爱康宁具有较高的萃取回收率(86%)，同时也获得了极佳的准确度(102%)和精密度(0.7%)。99%的基质效应表明只有1%的信号因基质干扰引起的微弱离子抑制作用而损失，从而证明了经 Plexa 吸附剂处理的提取物具有优异的纯净度。 表2.在限量浓度条件下进行方法评价， n=5 % 处理效率* 85 萃取回收率* 86 基质效应* 99 准确度** 102 精密度**(CV) 0.7 *在限量浓度条件下测定 **在40%量量浓度条件下测定 本文所描述的固相萃取样品制备与LC/MS/MS检测相结合的分析方法完全符合 SAMHSA 要求， 为认证实验室的药物测试或其它有类似要求的分析环境的测试提供高准确度、高精密度、高重现性的有法律效力的数据结果。其硬件配置与2011 版 SAMHSA方法中的相同均来自安捷伦。这些方法特别为安捷伦1100和安捷伦1200 LC 系列的所有用户开发，这些LC系统的最高背压均不超过400bar。采用其它型号的安捷伦三重四极杆 LC/MS系统应用本方法时，离子源参数可以很容易地进行修改。安捷伦科技可提供电子版本的LC/MS/MS数据采集和定量分析方法。 ( 参考文献 ) ( I . 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Journal of Analytical Toxicology，33：398-408. 安捷伦科技公司对本资料所包含的错误，以及由于使用本资料引起的相关损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2012 2012年1月10日，中国印刷 5990-9624CHCN Agilent Technologies 摘要由美国药物滥用与精神健康服务管理局（SAMHSA）颁布，于2010 年10 月生效的新准则，允许在政府认证的药物检测实验室采用LC/MS/MS 法确认初步药物测试结果。由于LC/MS/MS 法不需要衍生步骤，因此它远比以前应用的GC/MS 法要简便的多。我们提出了一种满足最新SAMHSA 准则要求的苯甲酰爱康宁的分析方法，并对其线性、检测限（LOD）、准确度和精密度进行论证，还对该方法的基质效应、萃取回收率和总处理效率进行了考察。这是涵盖所有SAMHSA 监控药物类别的一系列六种简便检测方法之一，该方法主要使用安捷伦产品进行分析，包括Agilent Bond Elut Plexa PCX 混合模式聚合物SPE 吸附剂，Agilent Poroshell 120 EC-C18，2.7μm 表面多孔LC 色谱柱，Agilent 1200 Infinity LC 系统以及采用安捷伦喷射流技术（AJST）增强电喷雾离子源的Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS 系统。前言苯甲酰爱康宁（BE）是可卡因存在于尿液中的一种主要代谢产物，可卡因是强烈的具有成瘾性的神经系统兴奋剂和局部麻醉剂。可卡因可在酶催化下水解为苯甲酰爱康宁（发生在肝脏），也可以不经过酶催化，而在碱性pH 条件下生成苯甲酰爱康宁（Anon.，2011）。苯甲酰爱康宁可在摄入可卡因后的几天内在尿液中检出。在冷冻贮藏的尿样中苯甲酰爱康宁相对稳定，而在较高温度和碱性条件下，它能进一步发生水解。SAMHSA 规定苯甲酰爱康宁的最高限量浓度为100 ng/mL，其检测限为限量浓度的 10%，即10 ng/mL。由于Agilent Bond Elut Plexa 吸附剂的独特性质，本文所描述的提取方法实现了对苯甲酰爱康宁萃取的高回收率提取，且重复性好。不像其它聚合物吸附剂，Plexa 颗粒具有无氨基的羟基化表面，避免了蛋白质的结合。从而获得了最小的离子抑制作用和最高的检测灵敏度。高流速和良好重现性的实现，主要得益于Plexa柱填料的窄粒径分布，并且不存在容易导致堵塞的细颗粒。采用Agilent Poroshell 120 EC-C18，3 × 50 mm，2.7 μm 色谱柱是由于其具有较高的载样量和极佳的分离性能。填充表面多孔 2.7 μm 颗粒的Poroshell 120 色谱柱能提供与亚2 μm UHPLC 色谱柱类似的柱效，但其背压却减少了约40%。因此，它甚至允许用户在耐压400 bar 的常规液相系统上采用较高的流速来提高分辨率，并同时缩短分析时间和再平衡的时间。在较小的样品进样体积（2 μL）且无样品预富集的条件下，该方法具有极佳的信噪比（样品浓度10 ng/mL 时>400:1，此浓度是 SAMHSA 规定限量浓度的10%），这得益于采用了AJST 技术的 Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS 系统电喷雾离子源增强了检测灵敏度。安捷伦以前的分析方法（由Moorman 和Hughes 开发, 2010）采用的是Agilent 6410 Triple Quadrupole LC/MS 系统和其它的 SPE/LC 产品和操作步骤。结论本文所描述的固相萃取样品制备与LC/MS/MS 检测相结合的分析方法完全符合SAMHSA 要求，为认证实验室的药物测试或其它有类似要求的分析环境的测试提供高准确度、高精密度、高重现性的有法律效力的数据结果。其硬件配置与 2011 版SAMHSA 方法中的相同均来自安捷伦。这些方法特别为安捷伦1100 和安捷伦1200 LC 系列的所有用户开发，这些LC 系统的最高背压均不超过400bar。采用其它型号的安捷伦三重四极杆LC/MS 系统应用本方法时，离子源参数可以很容易地进行修改。安捷伦科技可提供电子版本的LC/MS/MS 数据采集和定量分析方法。