血液中酒精检测方案(气相色谱仪)

作者 Haleigh Boswell 和 Frank Dorman宾夕法尼亚州立大学 帕克大学，美国宾夕法尼亚州 Ken Lynam 安捷伦科技有限公司 使用双双/双 FID 精确、高重现地测定血醇 应用简报 法医和毒理学 摘要 本应用简报重点介绍了使用双通道血醇分析仪，采用 Agilent J&W DB-ALC1 和 DB-ALC2色谱柱，通过静态顶空 GC/FID分析血醇浓度。双柱/双FID的配置组合在测定复杂血液基质中的酒精时能够提供良好的精度和重现性。 前言 顶空气相色谱最常见和最普遍的一个应用是测定定酒驾驶人员血液中的乙醇含量[1]。判断是否酒驾的通用阈值是 0.08 g/dL， 测定方法必须稳定和经过优化，以确保报告值的准确性。虽然酒精检测是法医实验室的常规分析项目，但也可能发生细微的误差，从而改变最终的报告值。 定量分析时使用内标法有助于抵消基质差异[1]。实验中通常选择与乙醇性质相似的其他醇类(如，正丙醇和叔丁醇)作为内标物。这些内标物与乙醇的化学极性相似，在血液中的基质效应也相同，所以选择这些内标物能够补偿基质效应。与外标法相比，使用内标法校正的百分比误差更小。 在方法检测限和阈值两个浓度下均重复测定样品，通过计算得到相对标准偏差，确定方法的精度。使用正丙醇和叔丁醇做为内标，顶空法最高可测定0.30 g/dL的血醇样品。 材料与方法 使用带分流/不分流进样口的 Agilent 7890B GC/FID、带顶空控制软件 ChemStation (B.01.04版) 的Agilent 7697A顶空进样器和用于气相色谱系统的 Agilent OpenLab CDS ChemStation软件(C.01.05版) 进行 GC/FID 实验。 图1.使用安捷伦双柱/双 FID测定血醇时的实验设置 ( 样品前处理 ) ( 乙醇参比标样购自 Restek， Bellefonte(美国宾夕法尼亚州)。 标样的前处理步骤同样品，即将500pL各参比标样溶液加入4.5mL 蒸馏水和5pL经稀释的内标物中。 ) ( 将正丙醇或叔丁醇(J.T. Baker) 用蒸馏水稀释10倍，制为内标储备溶液，则最终工作理论浓度为 0.08 g/dL。向20mL呃已知的 消毒羊血中分别加入5 pL 和 20pL乙醇 (200 proof无水乙醇， KOPTEC USP)， 制得0.02 g/dL 和0.08 g/dL 乙醇浓度已知的储 备血液样品。 ) 结果与讨论 图2和图3所示为8种化合物标样混合物通过 DB-ALC1 (FID1)和DB-ALC2 (FID2) 获得的分离色谱图。在定性鉴定时，每种标样的保留时间都能准确匹配其相应单独标样的保留时间。尽管混合物在单柱上存在多个共流出现象，但是我们能够借助它们在 DB-ALC1 和 DB-ALC2 上的保留时间辨别它们的流出顺序，进而进行后续的峰鉴定。该双柱方法的一个优点在于乙醇和其他常见代谢物在两个不同固定相上的流出顺序不同。双柱/双 FID 方法为我们提供了额外的确认信息，减少了干扰或其他醇类与乙醇共流出的可能。 图2.使用 FID 1、Agilent J&W DB-ALC1 气相色谱柱分离混合物 图3.使用 FID 2、Agilent J&W DB-ALC2 气相色谱柱分离混合物 表1总结了分别使用叔丁醇和正丙醇做为内标时，乙醇标称浓度分别为0.02%和0.08%的样品重复测定10次的结果。总体而言，叔丁醇做为内标时的结果变异性大于正丙醇。使用叔丁醇作为内标时，0.02%和0.08%乙醇样品重复测定的% RSD 值最高可达17.08%，使用正丙醇作为内标时， % RSD 值最高仅为 4.53%。以正丙醇做为内标， 0.02%和0.08%乙醇浓度下的% RSD 值较一致，均低于5%，证明该方法精度十分优异。 图4和图5所示为两种内标法的校准曲线。很明显，以正丙醇做内标获得的结果更好，因为其测定值与理论值更接近。与叔丁醇内标相比，以正丙醇做内标时相对响应系数和回归线的斜率均更高，进一步说明使用正丙醇做为内标的效果更好。 叔丁醇是一种熔点较低(熔熔25~26°℃)的固态物质，如果实验室温度控制不够理想，尤其是在冬季，则可能会带来一些麻烦。而异丙醇的熔点为-89°℃，即使温度低于水的凝固点，它也仍会以液态形式存在。 表1.使用叔丁醇和正丙醇做为内标时的平均相对响应系数和计算出的乙醇平均值、标准偏差、方差以及% RSD 值 0.02重复检测 0.08重复检测 0.02重复检测 0.08重复检测 FID 1 FID2 FID 1 FID 2 FID 1 FID 2 FID1 FID 2 平均值 0.20586 0.01562 0.08132 0.08156 0.01986 0.01938 0.08916 0.08823 标准偏差 0.03516 0.00067 0.00755 0.00749 0.00087 0.00088 0.00398 0.00400 方差 1.24E-03 4.43E-07 5.71E-05 5.61E-05 7.57E-07 7.71E-07 1.59E-05 1.60E-05 %RSD 17.08% 4.26% 9.29% 9.18% 4.38% 4.53% 4.47% 4.53 图 4A.使用 FID 1 所得的正丙醇内标校准曲线 图4B.使用 FID2所得的正丙醇内标校准曲线 0.08- 0.35 图5A.使用 FID 1 所得的叔丁醇内标校准曲线 图 5B.使用 FID 2 所得的叔丁醇内标校准曲线 图6为两根色谱柱所得前期系统峰以及目标峰的叠加图。很明显，系统峰不会干扰目标峰。 图6.叠加色谱图表明早期流出的系统峰与乙醇和内标峰分离良好 图7和图8分别为两种乙醇浓度下第一针和第十针样品的叠加图。尽管在峰面积上存在一些差异，但仍然实现了基线分离。值得注意的是，虽然所有的样品都是在同一时期由同一分析人员制备，仍然有比较明显的差异。 pA 图7.0.08%浓度的乙醇第一针和第十针重复进样的叠加图 图8.0.02%浓度的乙醇第一针和第十针重复进样的叠加图 结论 Agilent J&W DB-ALC1， 30 mx0.32 mm， 1.8 um 和DB-ALC2，30mx0.32 mm， 1.2 um 气相色谱柱在测定复杂血液基质中的血醇浓度时表现出了卓越的精度和重现性。分别使用正丙醇和叔丁醇做为内标时，结果存在显著差异。总体而言，重复样品检测中使用正丙醇作为内标所得的结果精度更高。以正丙醇作为内标时，0.02 g/dL 和 0.08 g/dL浓度的重复样品在两根色谱柱上所得结果的相对标准偏差均小于等于5%。 在DB-ALC1 和 DB-ALC2 上使用正丙醇做为内标，进行连续校准验证时，两根色谱柱上的误差均小于6%。而使用叔丁醇做为内标时，连续校准验证的误差约为10%。 ( 很明显，在使用静态顶空 GC/FID 双柱 (DB-ALC1和 DB-ALC2)、双 FID 配置分析血农浓度时，正丙醇是理想的内标选择。 ) 使用全自动安捷伦气相色谱顶空系统进行高通量血醇分析时，采用双柱配置、带 CFT分流器的分流进样、可塑金属密封圈以及Agilent J&W DB-ALC1 和 DB-ALC2色谱柱，分析周期仅为3分钟，而且还能完美分离乙醇、内标以及四种潜在的干扰物质。 ( 参考文献 ) ( 1. B. Kolb， L. B. Ettre. Static Headspace-Gas Chromatography： Theory and Practice (2nd ed)， John Wiley & Sons， Inc.，Hoboken， NJ， USA (2006). ) 更多信息 ( 这些数据代表典型结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请 访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn ) www.agilent.com/chem/cn 安捷伦公司对本资料中可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的直接或间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2013 2013年11月27日， 中国印制 5991-3671CHCN Agilent Technologies     摘要    本应用简报重点介绍了使用双通道血醇分析仪，采用Agilent J&WDB-ALC1 和DB-ALC2色谱柱，通过静态顶空GC/FID 分析血醇浓度。双柱/双FID 的配置组合在测定复杂血液基质中的酒精时能够提供良好的精度和重现性。    前言    顶空气相色谱最常见和最普遍的一个应用是测定醉酒驾驶人员血液中的乙醇含量[1]。判断是否酒驾的通用阈值是0.08 g/dL，测定方法必须稳定和经过优化，以确保报告值的准确性。虽然酒精检测是法医实验室的常规分析项目，但也可能发生细微的误差，从而改变最终的报告值。    定量分析时使用内标法有助于抵消基质差异[1]。实验中通常选择与乙醇性质相似的其他醇类（如，正丙醇和叔丁醇）作为内标物。这些内标物与乙醇的化学极性相似，在血液中的基质效应也相同，所以选择这些内标物能够补偿基质效应。与外标法相比，使用内标法校正的百分比误差更小。    在方法检测限和阈值两个浓度下均重复测定样品，通过计算得到相对标准偏差，确定方法的精度。使用正丙醇和叔丁醇做为内标，顶空法最高可测定0.30 g/dL 的血醇样品。    材料与方法    使用带分流/不分流进样口的Agilent 7890B GC/FID、带顶空控制软件ChemStation（B.01.04 版）的Agilent 7697A 顶空进样器和用于气相色谱系统的Agilent OpenLab CDS ChemStation 软件（C.01.05 版）进行GC/FID 实验。    结论    Agilent J&WDB-ALC1，30m×0.32 mm，1.8 μm 和DB-ALC2，30 m × 0.32 mm，1.2 μm 气相色谱柱在测定复杂血液基质中的血醇浓度时表现出了卓越的精度和重现性。分别使用正丙醇和叔丁醇做为内标时，结果存在显著差异。总体而言，重复样品检测中使用正丙醇作为内标所得的结果精度更高。以正丙醇作为内标时，0.02 g/dL 和0.08 g/dL 浓度的重复样品在两根色谱柱上所得结果的相对标准偏差均小于等于5%。    在DB-ALC1 和DB-ALC2 上使用正丙醇做为内标，进行连续校准验证时，两根色谱柱上的误差均小于6%。而使用叔丁醇做为内标时，连续校准验证的误差约为10%。    很明显，在使用静态顶空GC/FID 双柱（DB-ALC1 和DB-ALC2）、双FID 配置分析血醇浓度时，正丙醇是理想的内标选择。    使用全自动安捷伦气相色谱顶空系统进行高通量血醇分析时，采用双柱配置、带CFT 分流器的分流进样、可塑金属密封圈以及Agilent J&WDB-ALC1 和DB-ALC2 色谱柱，分析周期仅为3 分钟，而且还能完美分离乙醇、内标以及四种潜在的干扰物质。