毒驾样品（血浆、唾液和尿液）中11 种常见毒品检测方案(液质联用仪)

采用 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统分析毒驾样品中的11种常见毒品 作者 摘要 蒋畅、杨霞、胡培斌安捷伦科技(中国)有限公司 本文采用 Agilent 1290 Infinity l 液相色谱系统和 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统建立了一种分析毒驾样品(血浆、唾液和尿液)中11种常见毒品的方法。结果表明，Agilent Captiva EMR Lipid 过滤柱和 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱对目标化合物具有较高的回收率，并且 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统表现出优异的线性范围(1pg/mL-100 ng/mL)和灵敏度(定量限为1 pg/mL-100 pg/mL)。 毒驾是指“吸食、注射鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻、可卡因，以及国家规定管制的其他能够使人形成划癖的麻醉药品和精神药品后驾驶车辆，并且血液、唾液中毒品含量达到或超过规定阈值的行为”M。这种行为存在严重的安全隐患。因毒驾引发的交通事故不断增多，导致多人伤亡的恶性交通事故更是时有发生。我国公安部于2017年5月颁布了《车辆驾驶人员体内毒品含量阈值与检验》 (GA1333-2017)m，明确规定了11种毒品在血液和唾液中的含量阈值，但是该标准未对具体实验室检测方法做出规定。 本文使用了全新的Agilent Captiva EMR Lipid 过滤柱和 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱分别对血液和尿液进行前处理，然后使用 Agilent 1290 Infinity ll 液相色谱系统和Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统对样品中11种毒品的含量进行测定。整个样品前处理过程简单、快速，分析过程只需13 min，灵敏度可达 pg/mL 级， 完全满足 GA1333-2017的要求。 试剂和样品 所有11种毒品标准品以及尿样均来源于某市公安客户。 甲酸、乙酸、乙酸铵、乙酸乙酯、异丙醇、氨水购自 Dikma公司，乙腈(质谱纯)、甲醇(质谱纯)购自 Merck 公司(Kenilworth， USA)。水由 Milli-Q超纯水系统制得。 仪器和设备 Agilent 1290 Infinity ll 液相色谱系统，配备 G7120A 型二元泵、G7167B 型自动液体进样器、G7116B型柱温箱和 G7117B型二极管阵列检测器； Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统； Eppendorf Mini Spain plus 离心机； Agilent Captiva EMR Lipid 过滤柱，1mL(部件号5190-1002)；Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱，30mg， 3mL (部件号12108303)； Agilent Captiva Nylon 0.2 pm 滤膜。 液相色谱条件 色谱柱： Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱2.1 mmx50 mmx1.8 um (部件号959757-902)柱温： 35°℃ 进样体积： 1pL 流动相： A) 0.1%乙酸+5 mmol/L 乙酸铵水溶液B)甲醇 运行时间： 13 min 流速： 0.2mL/min 梯度程序： 时间(min) B% 0 51 5288.513 质谱条件 采集极性： 正模式/负模式 鞘气温度： 400°C 鞘气流速： 12L/min 干燥气温度： 250°℃ 干燥气流速： 6 L/min 雾化器压力： 30 psi 毛细管电压： (+)2500V； (-)3000V 喷嘴电压： (+)0V；(-)500V Delta EMV： (+) 300V； (-)500V 校准曲线的绘制 用甲醇水溶液(水：甲醇=50：50)将11种毒品标准品混合溶液稀释成1 pg/mL-100 ng/mL 的系列校准标样，由此绘制标准曲线，并用外标法进行定量。 血浆样品前处理 在 Captiva EMR Lipid 过滤柱上加入400 pL1%甲酸的乙青溶液，然后用移液枪加入100 pL 血浆，并用移液枪反复抽吸混合液体3-5次，使蛋白质发生沉淀；对过滤柱加压或抽真空 1 min(2-4英寸汞柱)；收集滴落的液体，直接上机检测。 唾液样品前处理 取唾液样品 0.5 mL，向其中加入1.5mL乙腈，使蛋白质发生沉淀；在15000 rpm的转速下离心，取上清液上机检测。 尿液样品前处理 取尿液1mL， 向其中加入1mL2%甲酸水溶液，涡旋混合；然后将溶液加载到经1mL甲醇活化和1mL2%甲酸溶液平衡的 Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱上，依次用1mL2%甲酸溶液和 1 mL含2%甲酸的40%甲醇溶液淋洗；在真空状态下抽干5-10 min (10-15 英寸汞柱)；再用1mL新鲜配制的乙酸乙酯：异丙醇：氨水 (50：50：20) 溶液洗脱，将流速控制为每3-5秒一滴；自然滴落结束后，再加入1 mL 乙酸乙酯：异丙醇：氨水 (50：50：20)溶液洗脱，再次自然滴落，将流速控制为每3-5秒一滴，再用低真空抽滤(2-3英寸汞柱)；收集滴落的液体后，在低于37°℃的温度下用氮气吹至近干，加入100 uL 0.025 mol/L 盐酸溶液，用氮气吹干，再复溶于1mL 甲醇：水 (50：50)中；经0.2 pm 滤膜过滤后上机检测。 表1列出了 GA1333-2017 中涉及的11种毒品的名称及其血液和唾液中的含量阈值。表2为11种毒品的动态多反应监测(dMRM) 离子对。 表1.GA1333-2017 中涉及的11种毒品的名称及其血液和唾液中的含量阈值 GA1333-2017要求检验的目标化合物 分子式 分子量 血液含量阈值 (ng/mL) 唾液含量阈值 (ng/mL) CAS号 6-单乙酰吗啡 CHNO， 327.14706 10 5 2784-73-8 吗啡 CH，NO， 285.13649 10 20 57-27-2 可卡因 CHNO. 303.14706 10 10 50-36-2 苯甲酰爱康宁 C6HNO， 289.13141 50 10 519-09-5 四氢大麻酚 C21H3092 314.22458 2 1 1972-08-3 四氢大麻酸 CH280 344.19876 5 / 56354-06-4 甲基苯丙胺 CioHgN 149.12045 20 25 537-46-2 苯丙胺 C，HN 135.1048 20 25 300-62-9 3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺 CHgNO， 193.11028 20 25 42542-10-9 3，4-亚甲二氧基苯丙胺 CoH3NO， 179.09463 20 25 4764-17-4 氯胺酮 CH CINO 237.09204 20 20 6740-88-1 表2.11种毒品的 dMRM 离子对 化合物名称 母离子 子离子 碎裂电压 (V) 碰撞能量(eV) 池加速电压(eV) 保留时间(min) 保留时间窗口 (min) 极性 6-单乙酰吗啡 (6-Acetylmorphine) 328.2 211 140 28 4 6.3 1 正 328.2 165 140 44 4 6.3 1 苯丙胺 (Amphetamine) 136.1 119 70 4 4 5.95 1 正 136.1 91 70 16 4 5.95 1 苯甲酰爱康宁 (Benzoylecgonine) 290.1 168 110 20 4 8.36 1 正 290.1 77.1 110 65 4 8.36 1 可卡因 (Cocaine) 304.2 182 120 16 4 10.1 1 正 304.2 82.1 120 32 4 10.1 1 氯胺酮(Ketamine) 238.1 220 80 12 4 9 1 正 238.1 125 80 32 4 9 1 3，4-亚甲二氧基苯丙胺(MDA) 180.1 163 70 8 4 6.47 1 正 180.1 105 70 24 4 6.47 1 3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA) 194.1 163 90 8 4 6.65 1 正 194.1 105 90 24 4 6.65 1 甲基苯丙胺 (Methamphetamine) 150.1 119 80 8 4 6.32 1 正 150.1 91 80 20 4 6.32 1 吗啡 (Morphine) 286.2 165 150 40 4 2.7 1 正 286.2 152 150 65 4 2.7 1 四氢大麻酚 (THC) 313.2 245.1 160 28 4 12.07 1 负 313.2 179.1 160 28 4 12.07 1 四氢大麻酸(THC-COOH) 343.2 299.2 130 20 4 11.46 1 负 343.2 245.1 130 32 4 11.46 1 由于这11种毒品化合物的极性跨度较大，且包含苯丙胺类碱性化合物和大麻素类酸性化合物，这对样品前处理的要求较高。而且，将样品酸化后，苯丙胺类化合物带正电，通过离子相互作用被保留在 Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱上；而大麻素类的化合物则通过非极性作用吸附在 Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱上。由于高浓度有机溶剂会洗脱掉吸附在该固相萃取柱上的大麻素类化合物，因此在淋洗时并不适合采用100%甲醇这样常用的淋洗溶剂，所以最后选用含2%甲酸的40%甲醇溶液作为第二步淋洗溶剂。另外，苯丙胺类药物易于挥发，且易在样品前处理过程中随溶剂蒸发而发生损失，这样的情况下只能加入盐酸使其以盐的形式沉淀。因此最好在氮吹即将结束时加入盐酸，以避免形成氯化铵盐。大麻素类化合物极易吸附在塑料容器的表面，为了最大程度减小样品损失并保证方法的重现性，建议使用新鲜配制的样品储备液和校准标准样品，并采用经硅烷化或甲醇冲洗和干燥的玻璃器皿，并在样品前处理结束后立即进行分析。 6-单乙酰吗啡/甲基苯丙胺 图1.11种毒品(50 ng/mL) 的总离子流色谱图 本方法的色谱分析时间为13 min (见图1上图)。由于各种化合物极性差别较大，且采集模式兼有正模式和负模式，因此选择dMRM 采集模式。总离子流色谱图如图1下图所示，采用该梯度洗脱程序得到的色谱峰峰形良好。为实现高通量超快速检测，也可将分析时间压缩至2 min。 检测限和线性范围 使用6470三重四极杆液质联用系统对浓度极低的11种毒品进行检测，并对各种毒品在其定量限 (LOQ) 浓度下的检测稳定性进行考察，连续进样7针后求其浓度相对标准偏差(RSD)，并推算出各种毒品的仪器检测限 (IDL= t*%RSD * amount)。结果列于表3中。 表3.11种毒品的 LOQ 和 IDL 化合物名称 LOQ (pg/mL) RSD (%)， n=7 IDL (pg/mL) 苯甲酰爱康宁 5 8.1 1.27 甲基苯丙胺 10 11.2 3.52 3，4-亚甲二氧基甲基苯 丙胺 5 7.7 1.21 氯胺酮 5 9.2 1.45 可卡因 1 18 0.57 吗啡 10 9 2.83 苯丙胺 5 12.3 1.93 3，4-亚甲二氧基苯丙胺 10 10.3 3.24 6-单乙酰吗啡 10 13.4 4.21 四氢大麻酸 100 12.4 38.97 四氢大麻酚 1 9.2 0.29 图2为所得到的11种毒品的校准曲线。苯甲酰爱康宁、MDMA、氯胺酮、苯丙胺的线性范围为 5 pg/mL-100 ng/mL，可卡因的线性范围为 1 pg/mL-100 ng/mL，甲基苯丙胺、吗啡、MDA、6-单乙酰吗啡的线性范围为10 pg/mL-100 ng/mL， 四氢大麻酸的线性范围为 100 pg/mL-100 ng/mL， 四氢大麻酚的线性范围为1 ng/mL-100 ng/mL。 6-单乙酰吗啡 104甲基苯丙胺 y=5970.150211*X+15.083112 R^2=0.99718667 0.25- -0.25- 浓度(pg/mL) 1.9- R^2 =0.99823350 1.8- 1.7- 1.6- 1.5- 1.4 131 1.2- 1.1- 1- 0.9- 0.8- 0.7- 0.6- 0.5- 0.41 0.3- 0.2- 01 -5 0 510 15202530 3540455055 6065707580859095100105 浓度(ug/mL) 图2.11种毒品(苯甲酰爱康宁、MDMA、氯胺酮、苯丙胺、可卡因、甲基苯丙胺、吗啡、MDA、6-单乙酰吗啡、四氢大麻酸和四氢大麻酚)的校准曲线 回收率实验 根据 GA1333-2017 中规定样品中的毒品检测阈值，在空白样品中添加标准品并最终配制成相应浓度的样品(血浆2ng/mL， 唾液1 ng/mL， 尿液2 ng/mL)，经过样品前处理后，上机检测并计算回收率。 表4.11种毒品在三种基质中的回收率 化合物名称 尿液 (2ng/mL) 唾液 (1ng/mL) 血浆 (2 ng/mL) 苯甲酰爱康宁 101.1%-104.4% 97.2%-108.7% 82.5%-96.0% 甲基苯丙胺 96.8%-98.7% 102.6%-114.8% 96.0%-111.9% 3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺 100.2%-102.3% 95.4%-105.9% 95.2%-108.7% 氯胺酮 99.7%-101.4% 94.2%-105.3% 91.8%-101.7% 可卡因 102.6%-105.5% 94.7%-105.2% 91.5%-106.9% 吗啡 52.9%-54.9% 41.1%-51.8% 35.9%-42.6% 苯丙胺 84.6%-88.4% 98.4%-108.6% 96.3%-108.4% 3，4-亚甲二氧基苯丙胺 89.3%-91.7% 93.2%-107.9% 96.9%-111.2% 6-单乙先吗啡 63.4%-65.0% 119.8%-131.1% 102.2%-113.1% 四氢大麻酸 65.1%-74.8% 81.9%-97.4% 78.2%-91.2% 四氢大麻酚 74.1%-82.4% 67.6%-79.5% 60.2%-67.7% 在11种毒品中，吗啡的绝对回收率较低。如果期望提高回收率，可在样品前处理前加入同位素内标，对吗啡的浓度进行校正，以获得更准确的样品含量。 本文采用1290 Infinity ll 液相色谱系统/6470三重四极杆液质联用系统 (LC/MS/MS)与全新的 Captiva EMR Lipid 过滤柱和 Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱相结合，开发出一种对血液、唾液和尿液中的11种毒品化合物进行分析的方法。结果表明，除吗啡外，其余10种毒品均获得了良好的回收率。该方法的线性范围和灵敏度均满足 GA1333-2017规定的含量阈值要求。 ( 参考文献 ) 1.(GA1333-2017车史驾驶人员体内毒品含量阈值与检验 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( C安捷伦科技(中国)有限公司，2018 ) ( 2018年5月20日， 中国出版 ) ( 5991-9380ZHCN ) 摘要本文采用 Agilent 1290 Infinity Ⅱ 液相色谱系统和 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统建立了一种分析毒驾样品（血浆、唾液和尿液）中 11 种常见毒品的方法。结果表明，Agilent Captiva EMR Lipid 过滤柱和 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱对目标化合物具有较高的回收率，并且 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统表现出优异的线性范围 (1 pg/mL – 100 ng/mL) 和灵敏度（定量限为 1 pg/mL – 100 pg/mL）。前言毒驾是指“吸食、注射鸦片、海洛因、甲基苯丙胺（冰毒）、吗啡、大麻、可卡因，以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品后驾驶车辆，并且血液、唾液中毒品含量达到或超过规定阈值的行为”。这种行为存在严重的安全隐患。因毒驾引发的交通事故不断增多，导致多人伤亡的恶性交通事故更是时有发生。我国公安部于 2017 年 5 月颁布了《车辆驾驶人员体内毒品含量阈值与检验》(GA1333-2017)，明确规定了 11 种毒品在血液和唾液中的含量阈值，但是该标准未对具体实验室检测方法做出规定。本文使用了全新的 Agilent Captiva EMR Lipid 过滤柱和 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱分别对血液和尿液进行前处理，然后使用 Agilent 1290 Infinity Ⅱ 液相色谱系统和Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统对样品中 11 种毒品的含量进行测定。整个样品前处理过程简单、快速，分析过程只需 13 min，灵敏度可达 pg/mL 级，完全满足 GA1333- 2017 的要求。结论本文采用 1290 Infinity Ⅱ 液相色谱系统/ 6470 三重四极杆液质联用系统 (LC/MS/MS) 与全新的 Captiva EMR Lipid 过滤柱和 Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱相结合，开发出一种对血液、唾液和尿液中的 11 种毒品化合物进行分析的方法。结果表明，除吗啡外，其余 10 种毒品均获得了良好的回收率。该方法的线性范围和灵敏度均满足 GA1333-2017 规定的含量阈值要求。