活性药物成分中非对应异构体和位置异构体杂质检测方案(液相色谱仪)

使用 Agilent 1200 系列液相色谱系统进行杂质分析 ● 第3部分：方法开发的快速条件筛选 应用简报 Michael Frank 摘要 方法开发是当今的药物分析实验室最耗时的工作之一1。通常，条件筛选是第一步，然后是对已发现的最佳参数组合进行微调。本文介绍了采用安捷伦快速分离高通量色谱柱和 Agilent 1200 系列快速分离液相色谱 (RRLC)系速加速整个分析过程的一种途径。本文论证了如何在一天半的时间内，对定量分析活性药物成分中非对映异构体和位置异构体杂质的分离条件进行筛选和方法微调，最终获得了一种耐用的方法。最终的分析方法不仅比类似的传统方法要快得多，而且可以节省大量的溶剂。 开发和验证新的分析方法昂贵且耗时。因此，对于整个分析过程来说，任何可以减少单次分析运行时间的手段都是有益的，但不能影响分离度、灵敏度，尤其是稳定性。如今，填装亚 2 um 填料色谱柱的问世加上液相色谱仪的高性能，已能满足超过以往1000倍应用方法的需求，还能极大提升方法开发的速度。开始时常常要对一些分离条件如固定相、流动相参数(%B、缓冲液、pH和溶剂)，以及操作参数如梯度陡度、温度等进行宽范围筛选，以找到微调的最佳起始点。本文论证了采用 Agilent 1200 系列快速分离液相色谱 (RRLC) 系统和多种安捷伦 ZORBAXRRHT 色谱柱， 寻求每次分析运行时间低于4 min 的分离条件，以及分离非对映化合物和位置异构体的效率。 实验部分仪器 ·配备 Agilent 1200 系列微型真空脱气机的Agilent 1200 系列SL型二元泵 ·配备温控的 Agilent 1200 系列 SL型高效自动进样器 ·Agilent 1200 系列 SL型温温箱 ·Agilent 1200系列SL型二极管车列检测器。本实验中使用5pL/6mm和13 pL/10 mm 流通池 ·填充不同固定相和不同规格的ZORBAX RRHT 1.8 pm 颗粒填料色谱主流动相为添加了不同改性剂和不同pH范围，由 Millipore 装置制备的梯度级水。强溶剂购自默克公司(德国达姆施塔特)的梯度级乙腈和甲醇。溶剂无需进一步过滤。采用 Agilent ChemStation B02.01SR1软件进行仪器控制和数据采集。 本方法开发的目的是要获得快速而可靠的方法，用于对药物生产中产生的杂质进行定量分析，该药物是一种碱性盐， pKa为9.4，易溶于水，特别是在酸性条件下。从以前的实验中2，我们可以了解到，除了高效液相色谱以外，还可以采用气相色谱和薄层色谱等的其它方法轻松检测反应物(间溴苯甲醚和杂质E， 见图1)。因此我们重点关注非对映异构体杂质A和位置异构体脱氢产物B和C，以及去甲基产物D的分离。其结构已经通过离子阱质谱分析、7飞行时间质谱分析2，以及在制备纯化后采用核磁共振技术3得到解析。 图1 采用二极管阵列检测器，通过比较不同波长下得到的色谱图，我们选择了270 nm作为监测波长，因为在此波长下，所有目标化合物均具有强吸收带(图2)，并且基线几乎没有梯度漂移。鉴于主化合物和所有杂质均易溶于纯水，我们选择水来溶解样品。样品浓度为 0.7 mg/mL。在高浓度时，由于超载，我们可以看到主化合物有严重的拖尾现象。在初始条件筛选期间，选用富含杂质的样品和5-95%B的宽范围梯度，以及不同的固定相和流动相组合。所有使用的色谱柱均为50mmx 3.0mm内径，1.8 um粒径填料的 Agilent ZORBAX色谱柱。高压泵在低延迟体积配置条件下运行，检测器采用5 pL/6 mm 流通池。柱温设定为40°C。使用的固定相和流动相列于表1，色谱分析结果(保留时间和关键物质对的分离度)见图3和4。 图2 主化合物的紫外光谱 如预期所料，不同流动相和/或固定相的 响。色谱条件的错误选择，会造成样品选择性变化对色谱分析结果具有显著影 仅为三种成分(其中一种为主化合物) 实验序号 固定相 pH 流动相 改性剂 备注 1 SB CN 1.92 水/乙腈 TFA 梯度 5-95%B， 40°℃ 2 Extend C18 1.92 水/乙腈 TFA 梯度5-95%B， 40℃ 3 XDB C18 1.92 水/乙腈 TFA 梯度5-95%B， 40C 4 XDB C8 1.92 水/乙青 TFA 梯度5-95%B， 40°℃ 5 SB C18 1.92 水/乙腈 TFA 梯度5-95%B， 40℃ 6 XDB C8 6.01 水/乙腈 磷酸盐缓冲液 梯度5-95%B， 40℃ 7 XDB C18 6.01 水/乙清 磷酸盐缓冲液 梯度5-95%B， 40℃ 8 Extend C18 6.01 水/乙腈 磷酸盐缓冲液 梯度5-95%B， 40°℃ 9 SB CN 1.92 水/甲醇 TFA 梯度5-95%B， 40°℃ 10 XDB C18 1.92 水/甲醇 TFA 梯度5-95%B， 40°C 11 Extend C18 1.92 水/甲醇 TFA 梯度 5-95%B， 40℃ 12 SB C18 1.92 水/甲醇 TFA 梯度5-95%B， 40°℃ 13 XDB C8 1.92 水/甲醇 TFA 梯弟5-95%B， 40°℃ 14 SB CN 6.01 水/乙清 磷酸盐缓冲液 梯度5-95%B， 40℃ 15 SB C18 6.01 水/乙青 磷酸盐缓冲液 梯度5-95%B， 40℃ 16 Extend C18 11.0 水/乙腈 NH OH 梯度5-95%B， 40°℃ 17 SB C18 1.92 水/乙腈 TFA 从实验5的色谱柱转移到4.6mm内径色谱柱 18 SB C18 1.92 水/乙青 TFA 梯度5-50%B， 40°℃ 19 SB C18 1.92 水/乙清 TFA 梯度15-50%B， 40°℃ 20 SB C18 1.92 水/乙腈 TFA 梯度15-50%B， 20°℃ 21 SB C18 1.92 水/乙腈 TFA 梯度15-50%B， 60°C 22 SB C18 1.92 水/乙青 TFA 梯度17-45%B，30°℃， 最终方法 相当简单混合而成的假象出现(如磷酸盐缓冲液与 Extend C18 色谱柱结合)。通过改变色谱条件，位置异构体B和C 开始分离(如使用ZORBAX XDB C18 色谱柱，磷酸盐缓冲液)。最终非对异构体杂质A与主成分也实现了分离，揭示出该样品实际上包含五种化合物。 图3 初始条件筛选和微调的保留时间 图4 初始条件筛选和微调中关键物质对的分离度 筛选方法： 溶剂： (见表1) 温度： 40°C 流速： 1.2 mL/min 梯度程序： 0.00 min 5%B 3.00 min 95%B 3.50 min 95%B 停止时间： 3.50 min 后运行时间： 1.00 min DAD. 光谱图 190-500 nm (带宽1nm)，所有光谱 信号A： 270nm (10nm)， 参比波长500 nm (100 nm) 峰宽： >0.03 min (向应时间 0.2 s) 狭缝： 8nm 平衡： 预运行 进样量： 5pL 进样器： 自动延迟体积减小， 样品冲洗因子=20 进样针冲洗10s(甲醇) 在图5和6给出的一些实例中，论证了 选择性改变的影响。对不同筛选条件运行中获得的保留时间和分离度的评估表明，通常在弱酸性条件(磷酸盐缓冲液)下会得到最差的结果。当使用甲醇做强溶剂时，由于其黏度较高，会延长所有的保留时间。在寻找优化最佳起始点的过程中，仅考虑分离度低于2的关键物质对不超过一个，且无分离度接近于0的情况。只有实验1-5、13和16满足要求。虽然实验16具有最佳的初始分离度，但是却有最长的保留时间，因此不被优先考虑(还因为它使用了不适宜的碱性条件)。在类似的分离度下，实验13也有较长的保留时间。最终，只好从非常相似的实验1到5中选择一个进行进一步的优化和微调。使用氰基固定相和较陡的梯度，不能显著提高两个位置异构体杂质B和C的分离度。由于不同种类的键合 C18固定相和 C8固定相效果差异很小，因此我们选择 StableBond C18 色普柱进行进一步微调。首先，实验5的条件被转移到4.6mm 内径的色谱柱上，该内径是制造业 QA/QC 环境下的首选。通过按比例调整流速来完成转移。此外，高压泵在标准延迟体积配置下运行，使用内体积3pL的标准热交换器， ：二极管阵列检测器中采用 13 pL/10 mm 的流通池。分离度几乎不变，只是保留时间稍微有所增加，这是由于混合器和阻尼器增加的延迟体积造成的。通过缩小梯度范围，以及考察不同温度的效应来进行方法微调(图3和4)。遗憾的是，改变温度对两个关键物质对产生了相反的影响。降低温度时，杂质A和主化合物间的分离度上升，但位置异构体B和C的 图5 采用 StableBond CN 色谱柱，以甲醇作为强溶剂，位置异构体B和C展现为单一的、完美的高斯峰(上部曲线)。仅当换乙腈作为强溶剂时，两种化合物才会分开 图 6 pH 改变影响的图示， 采用 ZORBAX Extend C18色谱柱，乙腈作为强溶剂，顶部曲线采用 pH= 6.0 的磷酸盐缓冲液，中部曲线采用0.2% TFA 作为酸性改性剂(pH=1.9)，底部曲线采用0.2%氨水作为碱性改性剂 (pH=11) 分离度下降。升高温度优化了这两个位置异构体的分离度，但却使杂质A和主化合物之间的分离度变差。我们折中选择了30°℃。最终方法采用 ZORBAX StableBondC18色谱柱(50mmx 4.6 mm 内径，1.8 um)， 柱温30°℃(图7)， 在2.8 min内， pH=1.92 (0.2% TFA) 的水中按照17%-45%改变乙腈梯度，在45%时保持0.2 min， 获得的所有化合物间的分离度均大于3.表2列出了含有较低报告浓度杂质(主化合物的0.05%)样品分离的一些特征值。然后对该方法进行验证，并在制造业 QA/QC环境下5分析样品前检查其耐用性4。 图 7 将最终方法条件应用到包含较低报告浓度(主化合物的0.05%)的杂质样品上 化合物 时间 [min] 分离度 峰面积[mAU·s] 峰高[mAU] 峰宽[s] 峰面积[%] 质量[ng] 杂质D 0.853 0.25 0.180 1.30 0.050% 1.76 杂质A 1.349 15.96 0.23 0.150 1.38 0.046% 1.62 主化合物 1.489 3.21 497.10 222.200 2.11 99.791% 3492.69 杂质C 2.393 19.83 0.33 0.220 1.36 0.066% 2.32 杂质B 2.516 3.58 0.23 0.170 1.27 0.046% 1.62 表2 包含较低报告浓度杂质的主化合物样品分离的特征值 通过亚2 pm颗粒色谱柱进行条件筛选和方法微调，可显著缩短活性药物成分中非对映异构体和位置异构体杂质分离方法开发的时间。由于仅需相当短的筛选运行周期时间(4.5min)， 大量条件可以在短短一天内完成测试(包括重复实验和空白实验)。进一步的微调另需半天时间， 因此只要一天半，即可提供方法进行随后的方法验证，时间也可大大缩短4，因为最终方法的单次分析的运行时间很短，只有 4.0 min。还要记住很多随后在制造业 QA/QC实验室进行的分析。在多年的化合物生产中，分析时间还可以减少为传统方法所需时间的一小部分，从而不断缩短产品的发布时间，节省中间产品的储存成本，为其它产品的开发生产获得更早的市场反馈，并节省了每次分析的溶剂，因 为每次分析仅需要 8.8 mL 的流动相。 ( 参考文献 ) 1. Michael W. Dong，“Modern HPLCfor Practicing Scientists"， WileyInterscience，ISBN0-471-72789-X， 2006 2. Edgar Nagele "Impurity Profilingwith the Agilent 1200 Series LC ( System - Pa rt 1： Structure ) ( Elucidation of Impuritie s "(采用 ) ( Agilent 1200 系列液相色谱系统进行 ) ( 杂质分析- 第 1部分：杂质结构解析)，安捷伦应用简报，出版号5989-5617EN， ) 2006 ( 3. ) ( Udo Huber "Impurity Profilingwith the Agilent 1 200 Series LCSystem - P a rt 2 ： Isolation of Impurities with Preparative HPLC" (采用 Agilent1200系列液相色谱系统进行杂质分析-第2部分：采用制备型高效液相色谱分 离杂质)，安捷伦应用简报，出版号 5989-5618EN，2006 ) Angelika Gratzfeld-Huesgen "Impurity Profiling with the Agilent 1200 Series LC System， Part 4： Method Validation of a Fast LC Method" (采用 Agilent 1200 系列液相色谱系统进行杂质分析- 第4部分：快速液相色谱方法的方法 验证)，安捷伦应用简报，出版号 5989-5620EN， 2006 5. Angelika Gratzfeld-Huesgen "Impurity Profiling with the Agilent 1200 Series LC System Part 5：QA/QC Application Example with Complete Sequencing" ( (采用 Agilent 1200 系列液相色谱系统进 ) ( 行杂质分析-第5部分：具有完整步骤的 QA/QC应用实例)，安捷伦应用简报， ) ( 出版号5989-5621EN， 2 006 ) Michael Frank 是安捷伦科技公司(德国瓦尔德布隆)的应用化学家。 www.agilent.com/chem/1200rr c安捷伦科技(中国)有限公司，2010 2010年6月15日出版 出版号5989-5619CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 摘要方法开发是当今的药物分析实验室最耗时的工作之一。通常，条件筛选是第一步，然后是对已发现的最佳参数组合进行微调。本文介绍了采用安捷伦快速分离高通量色谱柱和Agilent 1200 系列快速分离液相色谱(RRLC) 系统加速整个分析过程的一种途径。本文论证了如何在一天半的时间内，对定量分析活性药物成分中非对映异构体和位置异构体杂质的分离条件进行筛选和方法微调，最终获得了一种耐用的方法。最终的分析方法不仅比类似的传统方法要快得多，而且可以节省大量的溶剂。前言开发和验证新的分析方法昂贵且耗时。因此，对于整个分析过程来说，任何可以减少单次分析运行时间的手段都是有益的，但不能影响分离度、灵敏度，尤其是稳定性。如今，填装亚2 μm填料色谱柱的问世加上液相色谱仪的高性能，已能满足超过以往1000 倍应用方法的需求，还能极大提升方法开发的速度。开始时常常要对一些分离条件如固定相、流动相参数（%B、缓冲液、pH 和溶剂），以及操作参数如梯度陡度、温度等进行宽范围筛选，以找到微调的最佳起始点。本文论证了采用Agilent 1200 系列快速分离液相色谱(RRLC) 系统和多种安捷伦ZORBAX RRHT 色谱柱，寻求每次分析运行时间低于4 min 的分离条件，以及分离非对映化合物和位置异构体的效率。结论通过亚2 μm颗粒色谱柱进行条件筛选和方法微调，可显著缩短活性药物成分中非对映异构体和位置异构体杂质分离方法开发的时间。由于仅需相当短的筛选运行周期时间(4.5 min)，大量条件可以在短短一天内完成测试（包括重复实验和空白实验）。进一步的微调另需半天时间，因此只要一天半，即可提供方法进行随后的方法验证，时间也可大大缩短，因为最终方法的单次分析的运行时间很短，只有4.0 min。还要记住很多随后在制造业QA/QC 实验室进行的分析。在多年的化合物生产中，分析时间还可以减少为传统方法所需时间的一小部分，从而不断缩短产品的发布时间，节省中间产品的储存成本，为其它产品的开发生产获得更早的市场反馈，并节省了每次分析的溶剂，因为每次分析仅需要8.8 mL 的流动相。扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”微信公众号，获取更多解决方案资讯。