赤松松针中挥发油检测方案(气质联用仪)

网络首发时间：2018-05-2111：30：21网剪期http：//kns.cnki.net/kcms/detail/44.1318.730180518.1629.008.htmlVol.37 No.5532~5382018年5月FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis) 沈正超等：全二维气相色谱/飞行时间质谱对赤松松针挥发油化学成分的分析第5期533 *通讯作者：杜振霞，教授，研究方向：分析化学， Tel： 010-64433909， E-mail： duzx@ mail.buct. edu. cn doi： 10.3969/j. issn. 1004-4957.2018.05.003 全二维气相色谱/飞行时间质谱对赤松松针挥发油化学成分的分析 沈正超，孙堂强， #胡雅静l，杜振霞*，杨丽华华 (1.北京化工大学理学院，北京 100029；2.北京东西分析仪器有限公司，北京 100032 ) 摘 要：选取产于小兴安岭的新鲜赤松松针，采用水蒸气蒸馏法提取其中的挥发油，并通过全二维气相色谱/飞行时间质谱(GCxGC/TOF MS)对松针挥发油进行分析和鉴定。对色谱条件进行了优化，确定调制周期为6s.二维色谱柱长为3 m， 二维柱箱相对一维柱箱温度高20℃为最佳色谱条件。通过分析，鉴定出217种物质，其中萜类124种，包含单萜48种、倍半萜64种、二二萜12种，共占总含量约69%，酯类33种，占总含量约12%，有机酸类6种，醇类15种，醛类15种，酮类11种和其他类化合物13种。相比于传统一维色谱(1DGC)，全二维气相色谱(GC×GC)能提供数倍的峰容量，并对一些天然产物的异构体有着很好的分离，因此其在复杂天然产物分析方面具有独特优势。 关键词：松针；挥发油；全二维气相色谱/飞行时间质谱(GCx GC/TOF MS)；化学成分分析 中图分类号：0657.63； TQ460.72 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2018)05-0532-07 Analysis on Chemical Composition of Volatile Oils in Red Pine Needles byComprehensive Two-dimensional Gas Chromatography - Time-of-flightMass Spectrometry SHEN Zheng-chao'， SUN Tang-qiang'， HU Ya-jing'， DU Zhen-xial*， YANG Li-hua (1. Faculty of Science， Beijing University of Chemical Technology， Beijing100029， China； 2. East & West AnalyticalInstruments Inc， Beijing 100032， China) Abstract： The volatile oils in fresh red pine needles from Xiao Hinggan Mountains，， were extractedby steam distillation， and then analyzed by comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry (GC×GC -TOF MS).. The chromatographic separation conditionswere optimized， and the best conditions were confirmed to be a modulation period of 6 s，。 a seconddimensional column length of 3 m， and a temperature of 20 ℃ for the second dimensional columnhigher than that for the first dimensional column all the time.Under the optimal conditions， 217kinds of compounds were identified based the NIST library， and the quantitative calculation was car-ried out by area normalization method. Total of the compounds identified was four times more thanthat identifiedby one-dimensionalgas chromatography (1DGC).124 terpenoids， including 48monoterpenoids， 64 sesquipenoids and 12 diterpenoids were identified from the volatile oils of freshred pine needles， accounting for about 69%)6 of all. And 33 ester compounds accounting for about12% of all， 6 organic acids， 15 alcoholic compounds， 15 aldehyde compounds， 11 ketone com-pounds and 13 other compounds were also identified. Compaired with the one-dimensional gas chro-matography， two-dimensional gas chromatography - time-of-flight mass spectrometry possesses higherresolution and sensitivity， and it shows a unique superiority in the analysis of complex natural prod-ucts. Key words： pine needles； volatile oils； comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry ( GC×GC/TOF MS)； analysis of chemical composition ( 收稿日期：2018-01-23；修回日期：2018-02-08 ) ( 基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金(ZZ1706) ) 赤松主要分布在我国东北地区，其多个部位具有药用价值，松针作为赤松的重要药效部位，受到了广泛关注。研究发现，松针在抑菌、降血压、降血脂、止咳化痰及抗感染方面作用突出2。周俊华等3]发现松针可以降低高血糖小鼠的血糖；马承慧等4]发现松针有较强的抗氧化及延缓衰老的作用；戴艺等15通过使用松针提取液对小鼠进行处理，发现了其在免疫调节方面的面用；李师等161用松针提取液作用于体外培养的癌细胞，发现松针具有抗肿瘤的功效；黄静等7发现松针能限制胃肠道对糖和脂肪的消化吸收，从而起到降血脂的作用。 已有研究显示，松针中挥发油的化学组成较为复杂，作为天然产物，所含物质种类太多，且存在大量异构体，采用传统的一维色谱进行检测存在局限性8。近年发展起来的全二维气相色谱(GCxGC )是一种新型分离检测技术，尤其适用于发发性复杂物质体系分离、成分的准确检测及微量有效成分结构的研究19]。其工作原理如下：色谱柱系统包含两根性质不同的色谱柱，样品先经一维柱(常为非极性的常规高效毛细管色谱柱)分离，流出的物质通过调制器的冷冻捕集和热喷，再以周期脉冲的方式重新进样至二维柱(常为极性的细短柱)进行再次分离[10-11] 与传统一维色谱(1DGC)相比，两根色谱柱分别根据沸点和极性将物质进行分离，峰容量近似为二维峰容量的乘积，极大地增加了峰容量从而提供大量信息，同时由于调制器再聚焦的作用，检测的灵敏度也能得到提高12]。基于全二维气相色谱在分析鉴定方面的众多优点，其在天然产物挥发油的分析方面显现了巨大的优势13-14。 本实验采用全二维气相色谱-飞行时行质谱联用(GCx GC/TOF MS)技术对松针挥发油进行了分析。通过优化分离条件，使复杂挥发油得以更好分离，提高了谱库检索的可靠度，可确认微量有效成分，并与一维色谱分离结果进行了对比分析。 实验部分 1.1 实验装置与材料 Milli-Q超纯水器(美国 Millipore公司)，98-1-C型数字控温电热套(天津泰斯特仪器有限公司)，250 mL 锥形瓶、250 mL梨形分液漏斗、直形冷凝管(北京化工厂)。实验材料为采自小兴安岭的新鲜赤松松针，乙酸乙酯( HPLC级)和沸石均购自北京化工厂。 1.2 松针挥发油的提取 取新鲜的赤松松针，裁剪至长度约1~2cm。称取20g剪碎样品放入500 mL 蒸馏烧瓶内，并加入200 mL 超纯水，搭建蒸馏装置，逐渐升温至沸腾。持续沸腾6h后，收集馏分，取适量乙酸乙酯进行萃取，静置分层后取上层清液，得到具有特殊芳香气味的微黄色液体，取1mL该液体进行氮吹，20min 后用乙酸乙酯复溶至500 pL，待上机测试。 1.3 GC ×GC/TOF MS 仪器系统 采用 GC xGC/TOF MS 3300 型台式全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪(北京东西分析仪器有限公司)进行检测。 气相部分由气相色谱仪和四喷口冷喷调制器共同组成，本实验中，调制周期为6s(热喷开启时间为500 ms， 关闭时间为5500ms)， 载气为氦气(纯度99.999% )。柱系统由两根色谱柱组成，第一根柱为非极性柱 HP-5MS(30 m×0.25 mm ×0.25 pm， 美国安捷伦科技公司)，第二根柱为中等极性柱DB-17(3 m×0.32 mm×0.25 um， 美国安捷伦科技公司)，两根柱通过毛细管柱连接器以串联的方式连接。柱压恒为84.25 kPa，进样口温度为260℃，进样方式为分流模式，分流比为30：1，进样体积为1pL。程序升温方式：一维柱箱起始柱温为50℃，保持3 min， 以4C/min 升至220℃，保持2min， 再以20℃/min 升至280℃，保持5 min。二维柱箱温度始终保持比一维柱箱高20℃。 质谱部分由高分辨率的飞行时间质谱仪组成，电子轰击电离源电离电压为70 eV， 检测器电压为1730V，离子源温度为230℃，接口温度为250℃。采集频率为50 spectrum/s，采集质量数范围为30~550 amu。 2 结果与讨论 2.1 GC×GC-TOF MS 条件的优化 2.1.1 调制周期的优化 调制器作为全二维气相色谱的核心，起着将一维柱流出的物质捕集、聚焦， 再将聚焦的组分迅速转移到二维柱头的作用。而调制周期作为调制器的重要参数，很大程度上影响物质的鉴定。为保证一维柱的分辨率，调制周期不宜过长，理论上调制周期应低于一维色谱峰宽的三分之一115。但调制周期过短，会出现在一个调制周期内的待测物未洗脱完毕，下一个调制周期的样品已进入二维柱的现象，即“圈绕(Wraparound)现象”[16]。在调制周期分别为4、6、8s时对松针挥发油进行了分析，图1分别给出了其 GC x GC 分离图。由图1A可知，调制周期为4s时红线圈出处即产生明显的圈绕现象，不利于谱图的分析；而调制周期为6s和8s时均无此现象，考虑到较短的调制周期能提高分辨率，并能使图像充满坐标轴，因此实验选择6s作为最佳的调制周期。 图1 不同调制周期下松针挥发油的 GC×GC分离图 Fig.1 GC×GC chromatograms of volatile oils of pine needles under differrent modulation periods A. 4 s； B. 6s； C. 8 s 2.1.2 二维色谱柱长的优化 二维色谱柱长对物质的分离有两方面影响：①柱长的增长使得物质在二维柱上的保留时间增加，可一定程度改善在二维柱上的分离；②如果柱长的增加导致圈绕现象，则需增加调制周期，而调制周期的增大会降低在一维柱上的分辨率^17]。实验在6s调制周期下，分别使用1m和3m长的二维色谱柱对松针挥发油进行分析，其GCxGC分离图见图2。比较了相同时段内1m和3m长二维柱条件下物质的分离情况，以相同的一维时段17.6~17.9 min 为例，二维柱长为1m时仅分离出1种物质： p-Mentha-1， 5-dien-8-ol，而3m时可分离出p-Mentha-1， 5-dien-8-ol、2-Nonenal，(E)-((E)-2-壬烯醛)和 Pinocarvone(松香芹酮)3种物质，表明二维柱长为3m时的峰容量明显得到改善。且在相同调制周期下，3m长二维柱条件下不产生圈绕现象，故最终选取3m 长的二维色谱柱用于分析。 图27不同二维柱长下松针挥发油的 GC ×GC分离图 Fig.2 GCx GC chromatograms of volatile oils of pine needles with diffrent second dimensional column lengthsA. 1m； B. 3 m 2.1.3 二维柱箱温度的优化 分别考察了二维柱箱温度相对一维柱箱温度始终高0、20、40℃条件下对松针挥发油的分析结果(图3)。二维柱箱温度的升高会使物质在二维柱上的相对保留时间减少，从而降低某些物质间的分离效果，图3中区域1表示苯类衍生物，区域2表示单萜类物质。由图3可见，随着二维柱箱温度的升高，区域1与2的分离效果逐渐变差，二维柱箱温度与一维柱箱温度相同时分 离效果最好。但由于正交分离能使得分离空间充分被利用，单对于1或2区域内的物质而言，物质的分离依靠沸点而非极性，适当提高二维柱箱的温度，能降低一维和二维柱间的相关性，更利于同类物质的正交分离。综合考虑，实验选择二维柱箱的最佳温度为始终相对一维柱箱温度高20℃。 图3 不同的二维柱箱温度下松针挥发油的 GC × GC分离图 Fig.3 GC×GC chromatograms of volatile oils of pine needles with different second dimensional column temperaturesA. keeping the second dimensional column temperature 0 ℃ higher than the first dimensional column temperature； B. keeping the seconddimensional column temperature 20 ℃ higher than the first dimensional column temperature； C. keeping the seconddimensional column temperature 40 ℃ higher than the first dimensional column temperature； 1. benzene derivatives(苯类衍生物)；2. monoterpenoids(单萜) 2.21DGC 与 GC ×GC 方法比较 只连接一维柱，气相色谱仪直接与飞行时间质谱仪连接，采集频率改为2 spectrum/s， 在其他条件相同情况下，采用一维气相色谱(1DGC)技术对松针挥发油进行分析。与1DGC 相比，全二维气相色谱的最大特点是峰容量大[18]，通过分析， 1DGC 技术分离鉴定出62种物质，而采用优化后的 GC ×GC 方法分离鉴定出217种物质，峰容量是前者的4倍以上。另一方面，相比于1DGC， GC × GC 鉴定出的物质与谱库的匹配度更高，因此对物质定性分析的准确度得到了提高。此外， GC × GC 在分析异构体方面也展现出独特优势，在本实验优化的 GC x GC 条件下，能分离出(-)-B-Bourbonene(B-波旁烯)、Co-paene(αx-蒎烯)和(1S，6R， 8S)-1，3-dimethyl-8-(propan-2-yl)tricyclo[4. 4.0.0~2，7~]dec-3-ene 这3种分子式同为 CisH的倍半萜，而此3种组分在1DGC上不能分离，仅表现为1个重叠峰。由此可见，在峰容量和对异构体分析方面， GC× GC 展现着巨大的优势，这对以后分析挥发或半挥发性复杂体系提供了重要的手段。 2. 3 松针挥发油中主要成分的鉴定 在优化实验条件下， GC × GC 的分离图见图4，共分离鉴定出217种物质，其中萜类124种，包含单萜48种、倍半萜64种、二二萜12种，共占总含量约69%；酯类33种，占总含量量12%；有机酸类6种，醇类15种，醛类15种，酮类11种和其他类化合物13种。如图4所示，1区域和2区域分别为单萜及倍半萜，含量较高，3区域为低含量的二萜。随着碳数的增加，上述3种萜类在一维上的保留时间逐渐增加。4区域为酯类，多为长链脂肪酸酯，含量仅次于萜类，由于极性较大，二维保留时间长，出现在谱图较上端。此外，谱图中还分布有少量醇类及羰基化合物。表1~2分别列出了松针挥发油中含量超过 0.4%的44 种萜类和8种酯类化合物的鉴定结果。 图4 松针挥发油的 GC × GC 分离图 Fig. 4 GC xGC chromatogram of volatile oils of pine needles 1. monoterpenoids(单萜)；2. sesquipenoids(倍半萜)；3. diterpenoids(二萜)；4. estercompounds(酯类化合物) 表1 GC ×GC/TOF MS 鉴定的主要萜类化合物 Table 1 Main terpenoids identified by GC × GC -TOF MS (续表1) 表2GC× GC/TOF MS 鉴定的主要酯类化合物 Table 2 Main ester compounds identified by GC x GC -TOF MS Peak 1"retention 2"retention Compound F Chemical Similarity degree Relative content No. time(min) time(min) formula (%) (%) 85 22.2 2.90 Bicyclo [2.2. 1] heptan-2-ol， 1， 7， 7- C12H2002 87 0.864 trimethyl-， acetate， (1S-endo)- 122 28.2 2.71 Nerolidyl acetate C17H2802 79 3.714 125 28.8 2.44 Acetic acid， 6， 6-dimethyl-2-methylene- C16H2404 68 1.426 7-(： 3-oxobutylidene ) oxepan-3- ylmethyl ester 154 32.0 2.26 Decanoic acid， ethyl ester C12H240， 78 0.658 182 36.8 4.65 Benzyl benzoate C14H1202 91 0.506 196 39.6 3.73 1，2-Benzenedicarboxylic acid， bis (2- C16H2204 84 0.593 methylpropyl) ester 197 39.7 2.95 Octadecanoic acid， ethyl ester C20H4002 76 0.539 205 42.8 2.18 Hexadecanoic acid， ethyl ester C8H0， 84 0.563 3 结 论 全二维气相色谱/飞行时间质谱适合于复杂体系的分析，本实验将其用于对松针挥发油的分析，并对色谱条件进行了优化，确定调制周期为6s，二维色谱柱长为3m，二维柱箱相对一维柱箱始终高20℃为最佳色谱条件。通过实验在松针挥发油中鉴定出217种物质，包括124种萜类、33种酯类及一些其他化合物，其中萜类含量最高，占总含量的 69% 。与1DGC 的对比验证了其在峰容量和分析异构体等方面的独特优势，在复杂天然产物的成分分析以及异构体的结构鉴定方面具有较好的前景。 ( 参考文献： ) ( Sun L M . Chin. Med.Herald(孙利民. 中国医药导报)，20 1 4， 11(23)：160-162. ) ( 2 Chen Y， Liu C G ， Z h ao Y Z ， Yin K. J . Anhui Agr i c. Sci. (陈英，刘成国，赵毓芝，殷.安徽农业科学)， 2012，40(10)： 5 994-5996. ) ( Zhou J H， Hu J C， Te n g H. China Prescription Drug(周俊华，胡景初，滕红 . 中国处方药)，2014， 12(9)： 12 2 -123. ) ( Ma C H， Wang Q， Liu M. J . Northeast For e stry Univ. (马承慧， 王 群，刘牧.东 北 林业大学学报)，2016， 44 (6)：45-48. ) ( 5 Dai Y， Xu M S， Shangguan X C ， Jiang Y， Zheng G D， Wang W J . Acta Zoonutrimenta Sinic a (戴艺，徐明生 ， 上 官 新晨，蒋艳，郑国栋，王文君.动物营养学报)，2017，29(2)：670-677. ) ( 65] Li S， Lei Y P， Shi X F ， Liu D Y， Wang B L ， Zhang L X. C hi n. P h aram. (李师，雷艳萍，石晓峰，刘东彦，王斌利，张莉霞. 中国药房)，2016， 27(31)：4406-4410. ) ( 71 Huang J， Zhang A Y， Z hou T G ， L u J T. S han Dong Med.J. (黄静，张爱元，周天罡，卢建涛.刊 . 山东医药)， 2015，55(34)：30-31. ) ( 18 Wang D D . Studies on Ex t raction of the Essential Oil from Eight Pinaceae Plants Pine Needles by Steam Method a nd GC/ MS Analysis. Changchun： Jilin Agricultural University(王得道.水蒸气法提取八种松科植物松针挥发油的研究及 GC/MS分析.长春：吉林农业大学)，2013. ) ( Kupska M， Chmiel T， Jedrkiewicz R ， Wardencki W， Namiesnik J. Food Chem.，2014，152(2)：88-93. ) ( Shi X， Wang S Y， Yang O， Lu X， Xu G W. Anal.Methods ， 2014，6(18)： 7 112-7123. ) ( Zhang H Q， R a o Z， W a ng X C， Xu D D， G u Z X， Qi n K， Guo F， Zhan N. J. Instrum . Anal. ( (张红庆，饶竹，王 晓春，许丹丹，谷子欣，秦恺，郭峰，战楠.分析测试学报)，2017，36(10)：1197-1202. ) ( 1 21 Kanat’ev a A Y， Dianov M E ， Kurganov A A . Pet. Che m .， 20 1 2，52(5)：356-361. ) ( 13] Wang K， Z hu R Z ， Qu R F， Li Z Y. Mendeleev Commun.， 2012，2 2 (1)：45 - 46. ) ( 14 Schmarr H G， Bernhardt J. J. Chromatogr.A， 2010， 1 217(4)： 5 65-574. ) ( 15 OmarJ， Alonso B ， Olivares M ， Vallejo A ， E txebarria N. Talanta， 2012， 88(88)： 1 4 5 -151. ) ( 16] Mostafa A， Edwards M， Górecki T. J. Chromatogr.A， 2012， 1 255(17)：38-55. ) ( 1 7| Klee M S， Cochran J， M errick M ， Blumberg L M. J . Chromatogr. A， 2015， 1 383：1 5 1-1 5 9 . ) ( 18 Meinert C， Meierhenrich U J. Angew. Chem . Int. Ed.， 201 2 ，51(42)： 1 0460-10470. ) 赤松主要分布在我国东北地区，其多个部位具有药用价值。松针是赤松重要的药效部位，受到了广泛的关注。本文采用全二维气相色谱/飞行时间质谱（GCxGC/TOF MS），通过对色谱条件的优化，分析了松针挥发油化学成分。相比于传统的一维色谱，突显了全二维气相色谱的高分辨率、高灵敏度、高峰容量等对一些复杂的挥发油成分分析的独特优势。