蛋白多聚体中纯度检测方案(液相色谱柱)

应用笔记 SEC-UV-RI-MALS法高效分析蛋白质多聚体 静态光散射与尺寸排阻色谱的联用，在单克隆抗体(mAbs)的纯度检验或下游纯化的快速剑测方面来说是一项重要手段。光散射也是在荧光检测之外蛋白质多聚体的最敏感检测方法之一。 就其尺寸而言，mAb多聚体产生散射光时比其吸收214或280nm的UV光时更有效率。尽管如此，与简单的紫外检测相比，光散射并非一种即插即用的技术。本文提供了一些有助于提高信噪比和整个系统稳定性的建议。首先，务必保持整个系统清洁并经常更换洗脱溶液。当使用不含叠氮化钠的缓冲溶液时，应该要每天更换。当检测对象为蛋白质时，叠氮化钠不会在散射信号中引起任何问题。因此建议在含水缓冲溶液中加入0.05%的叠氮化钠，防止细菌生长。在使用有机溶剂时，对洗脱溶液进行适当的脱气至关重要. 对任何洗脱溶液，无论是有机溶剂还是水溶液，都需要进行彻底过滤。因为UV检测不到的气泡和小颗粒，对光散射信号会产生严重干扰。建议定期更换在线过滤器， 并使用0.1 um滤膜过滤缓冲溶液，1以避免基线噪音。由于样品自身杂质污染检测器的情况会经常出现，建议在没有安装色谱柱的系统中使用含1% SDS的水冲洗4~5小时，接着用水快速排气，并用20%乙醇和80%水的混合溶液过夜冲洗。对于持续的噪音，可以使用样品降解溶剂冲洗系统。分析蛋白质样品时，蛋白酶可能会有所帮助。 按照色谱柱操作手册中的清洗方法清洗色谱柱，可以减少HPLC色谱柱产生的噪音。色谱柱过载也会导致保留时间之外出现样品分子，导致噪音和漂移基线。TSKgel SWxL系列色谱柱可使用0.1M甘氨酸/盐酸缓冲溶液(pH 3)过夜冲洗以进行有效清洗。由于系统流速也会影响噪音级别，只可对流速渐进调整。用4~5倍柱体积的洗脱溶液在运行流速下平衡色谱柱可稳定基线。 单克隆抗体的SEC-UV-RI-LS分析 图1 MALS检测器： minDAWNTM TREOS， Wyatt Technology Corp. 实际上，静态光散射是一种多检测器测试方法，来自于浓度检测器UV或RI的浓度信号对其非常重要。由于在蛋白质检测的波长下叠氮化钠会吸收紫外线，并且所有蛋白质的折光指数增量大致相同，因此建议使用RI作为浓度信号来源。尽管如此，RI信号也有缺点，容易出现溶剂峰，使得与溶剂峰保留时间相同的分子无法检测。使用系统中日常更新的洗脱溶剂制备样品，可以减少溶剂峰。与溶剂峰相似，进样峰与样品本身无关，降低进样速度可以减小进样峰。 一般而言，系统中任何不稳定因素都会对光散射检测器产生影响。在进行连续分析之前，使用标准样品对系统进行适用性试验，以考察系统的测试性能。在确保光散射检测器的性能后，即可检测到蛋白质多聚体和单体，并得到其结构信息，如图1所示。         静态光散射技术与尺寸排阻色谱的联用，在单克隆抗体（mAbs）的纯度检验或下游纯化的快速检测方面来说是一项重要手段。光散射也是在荧光检测之外蛋白质多聚体的最敏感检测方法之一。就其尺寸而言，mAb多聚体产生散射光时比其吸收214或280 nm的UV光时更有效率。尽管如此，与简单的紫外检测相比，光散射并非一种即插即用的技术。        本文提供了一些有助于提高信噪比和整个系统稳定性的建议。