枇杷膏中熊果酸检测方案(液质联用仪)

田岛津SHIMADZUExcellence in ScienceSSL-CA14-186 Excellence in ScienceLCMSMS-203 D岛津全球应用技术开发支持中心咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn 三重四极杆质谱测定枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸的含量 LCMSMS-203 摘要：本文建立了衍生与岛津三重四极杆质谱仪LCMSMS-8050 相结合，超高灵敏度的测定枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。化合物的线性良好，相关系数大于0.999；其保留时间和峰面积比的相对标准偏差分别在 0.16~0.19%和 4.01~5.84%之间；齐墩果酸和熊果酸的检出限分别为0.92和1.06 ng/L， 定量限分别为3.07和3.53 ng/L，加标回收率分别在98.7~102.7%和97.2~105.0%之间。该方法可高灵敏度分析枇杷膏中的齐墩果酸和熊果酸的含量。 关键词：齐墩果酸熊果酸衍生三重四极杆质谱仪 齐齐果酸 (Oleanolic acid，OA) 和熊果酸(Ursolic acid，， LUA)是两种典型的三萜酸类化合物。研究表明，它们具有低的细胞毒性和广泛生物活性，例如具有杀虫、消炎、防流感、抗糖尿等功能。熊果酸现已被证明能够阻断艾滋病蛋白酶的聚合作用，同时对于其它恶性肿瘤细胞亦表现出强烈的抑制作用；齐墩果酸可减轻肝损伤，急性、慢性肝炎及肝硬化动物均有明显降酶作用。 然而齐墩果酸和熊果酸的化学结构中缺乏满意的发色团及可离子化的基团，导致其紫外和质谱响应均不理想。另一方面，两者的 化学结构非常类似(结构见图1)，其母离子和产物离子完全一致，这给分离和检测都带来巨大的难度。在本实验中，样品液液萃取后，加入衍生化试剂， N，N-二甲基乙二胺(DMED)和d4-N，N-二甲基乙二胺(d4-DMED)进行衍生，衍生后的化合物带有叔胺的基团，质谱响应好。产生d4-DMED-衍生物作为其待测物的内标物，采用内标法进行定量。 本文采用衍生的办法，大大增强其质谱响应，简便，快速，灵敏度高，可应用于枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸的检测。 图1.齐墩果酸(a)和熊果酸(b)的化学结构 ■实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津液相色谱仪 LC-20A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为 LC-20AD×2(输液泵)， DGU-20A3R(在线脱气机)， SIL-20A(自动进样器)，CTO-20A(柱温箱)， CBM-20A系统控制器， LCMS-8050 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.60 SP2 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： InertSustain C18 Column (2.1 mm I.D.x250 mm L.， 3 um) 流动相：0.1%甲酸水：乙腈=47：53(v/v) 流速：0.25 mL/min 柱温：35 洗脱方式：等度洗脱 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 离子源： ESI+ 雾化气流速： 2.0L/min 加热气流速： 10.0 L/min 接口温度： 300℃ DL温度： 250℃ 加热模块温度： 400℃ 干燥气流速： 10.0 L/min 扫描模式： 多反应监测(MRM)，MRM 参数见表1 表1.化合物信息及 MRM参数 序号 化合物 英文名 CAS 前体离子 产物离子 Q1Pre CE Q3Pre Bias(V) Bias(V) 1 齐墩果酸 Oleanic acid 508-02-1 527.30 482.30° -20 -34 -23 203.20 -20 -41 -20 2 熊果酸 Ursolic acid 77-52-1 527.30 482.30* -20 -34 -23 203.20 -20 -41 -20 3 D4-齐墩果酸 d4-Oleanic acid / 531.30 482.30° -20 -34 -23 4 D4-熊果酸 d4-Ursolic acid / 531.30 482.30* -20 -34 -23 注：表中前体离子、产物离子及 MRM 参数均为其衍生物数据 *表示定量离子 1.3样品制备 标准溶液处理：用乙腈配制0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和 10.0 ug/L 系列浓度的混合标 准工作液，取200 uL 标准工作液，加入10 pL 20 umol/mL 的三乙胺(TEA)和 10pL20 umol/mL LCMSMS-203的2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)， 涡旋 5 min， 再加入10 pL40 umol/mL DMED， 40℃ 1500rpm 振荡1h后氮气吹干，加入100 uL 流动相复溶。 样品前处理方法：取0.5g枇杷膏于50 mL容量瓶中，饱和食盐水稀释至刻度。取1mL样品， 加入200 uL乙酸乙酯，涡旋5 min 后静置，取上清液进行衍生。衍生步骤同标准溶液处理方法。 内标样品处理：取200 pL 10 ng/mL标准溶液，加入10 pL 20 umol/mL 的 TEA 和10 uL20umol/mL的 CMPI， 涡旋5 min， 再加入10 uL40 umol/mL d4-DMED， 40℃ 1500 rpm 振荡1h后氮气吹干，加入1mL 流动相复溶后，取10uL加至各标准溶液和实际样品中，混匀后上样。 结果讨论 2.1标准样品MRM 色谱图 图2.0.1 ug/L标准样品衍生后 MRM 色谱图 图3.0.1 ug/L内标样品衍生后 MRM 色谱图 OA 和UA 都是五环三萜类化合物，其区别仅仅是 OA 的C-20立上的一个甲基移位到 C-19位上，两者属于同分异构体，因此分离十分困难。本实验采用 3 um 的 InertSustain C18柱，在0.1%甲酸和水的流动相条件下， OA和UA的分离度R为1.110，优于绝大部分文献报道的结果。 2.2线性关系 将浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和 10.0 ug/L的混合标准溶液，按1.2及1.3中的 衍生条件及分析条件进行处理， OA 和UA 衍生物与其 d4-DMED 衍生物的浓度比为横坐标，峰 LCMSMS-203面积比为纵坐标，内标法制作校准曲线，如图4~5所示，线性方程、线性范围和相关系数见表 2. 图4.齐墩果酸标准曲线 图5.熊果酸标准曲线 表2.校准曲线参数 No. 名称 校准曲线 线性范围 相关系数r 准确度范围(%) (ug/L) 1 齐墩果酸 Y=(11.230)X+(0.480) 0.01~10.0 0.9995 81.7~117.8 2 熊果酸 Y=(12.197)X+(0.467) 0.01~10.0 0.9998 94.6~119.7 2.3重复性实验 配制浓度为 0.5 ug/L 的混合标液，衍生后平行测试6次。齐墩果酸和熊果酸的保留时间和峰面积比的相对标准偏差分别在0.16~0.19%和4.01~5.84%之间，仪器精密度良好。 表3.重复性数据 No 齐墩果酸 熊果酸 保留时间(min) 峰面积比值 保留时间 峰面积比值 1 8.535 6.07250 8.201 6.59214 2 8.527 6.36478 8.191 6.93121 3 8.527 6.36478 8.191 6.93121 4 8.508 6.86540 8.172 6.53191 5 8.500 6.39979 8.170 7.03620 6 8.497 6.33760 8.170 7.66669 RSD% 0.188 4.01499 0.162 5.84479 2.4灵敏度 配制浓度为 0.01 ug/L的混合标样，衍生后进样分析，根据 S/N=3 和10定义其检出限和定量限，齐墩果酸和熊果酸的检出限分别为0.92和1.06 ng/L，定量限分别为3.07和3.53 ng/L。 2.5基质加标实验 按照1.3中样品制备方法，测定空白枇杷膏，以及空白枇杷膏加标含量为100 mg/kg 样品，平行测定3次，加标回收率为扣除空白枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸含量的结果。齐墩果酸的加标回收率在98.7~102.7%之间，熊果酸的加标回收率在97.2~105.0%之间。 表4.基质加标回收率结果 No. 名称 回收率1% 回收率2% 回收率3% 平均回收率% 1 齐墩果酸 98.7 102.7 99.2 100.2 2 熊果酸 97.2 105.0 100.8 101.0 2.6实际样品测定结果 按照1.3中品品制备方法处理某品牌枇杷膏样品，平行测定2次，测得某样品中齐敦果酸和熊果酸的含量分别为7.40 和23.6 mg/Kg， 结果见图6所示。 图6枇杷膏样品 MRM色谱图 结论 本文建立了衍生与高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术同时测定枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。待测物线性良好，相关系数均大于0.999，定量限分别为0.92和1.06 ng/L。仪器的重复性良好，0.5 ug/L 混合标准溶液连续进样6次，保留时间和峰面积比的相对标准偏差范围分别在 0.16~0.19%和 4.01~5.84%之间。枇杷膏加标样品经过样品前处理后上机分析，回收率在97.2~105.0%之间。本法简单、快速、准确，可应用于枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸的高灵敏度检测需求。 本文建立了一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）同时测定齐墩果酸和熊果酸含量的分析方法，其中利用稳定同位素试剂——N,N-二甲基乙二胺（DMED）和d4-N,N-二甲基乙二胺（d4-DMED），分别衍生样品和标准工作溶液中的目标分析物，并将标准工作液的衍生产物作为稳定同位素内标。采用该同位素质谱探针标记技术，一方面可减小复杂样品中基质对目标分子的抑制，另一方面衍生化试剂结构中包含易离子化基团，可提高检测灵敏度。该方法线性关系良好，相关系数均>0.99；齐墩果酸和熊果酸的检出限（S/N=3）分别为0.92 ng/L和1.06 ng/L，加标回收率分别为98.7%~102.7%和97.2%~105.0%。该方法简单、快速、准确，可满足枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸高灵敏度检测的需求。