虎杖中蒽醌、二苯乙烯类(芪类) 、酚类、黄酮类检测方案

第28卷第4期2009年4月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVo1.28.No.42009-4 电堆积-非水毛细管电泳法同时分离测定虎杖中的有效成分 李利军*1， 吴峰敏?，李斯光》，喻来波》，吴健玲 (1.广西工学院生物与化学工程系，柳州545006；2.河南科技大学化工与制药学院，洛阳471003；3.广西大学化学与化学工程学院，南宁530005) 摘 要：建立了电堆积富集-非水毛细管电泳同时分离测定中药虎杖中的大黄素、白藜芦醇和虎杖苷的新方法。对各种影响因素做了系统的研究，确立了中药虎杖中3种有效成分的最佳电堆积和分离条件，以甲醇为非水介质，30mmol/L NaAc-4 mmol/L NaOH2 mmol/L CTAB 溶液为背景电解质，运行电压为-25kV，在220 nm波长下紫外检测。该法已应用于中药虎杖中大黄素、白藜芦醇和虎杖苷同时分离测定。 关键词：电堆积；非水毛细管电泳；大黄素；白芦醇；虎材答；虎权 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2009)04-055-04 中药虎杖为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspida-tum Sieb. et Zucc.)的干燥根茎及根，性微寒、味微苦，具祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰等功效。虎杖含蒽醌、二苯乙烯类(芪类)、酚类、黄酮类等多种成分，其中二苯乙烯类主要为白藜芦醇和白藜芦醇苷(虎杖苷)，蒽醌类主要以大黄素、大黄素甲醚为代表，也含有多种蒽醌苷。白藜芦醇及其具有抗肿瘤、保肝、抗氧化、降血脂、抑制血小板凝聚、调节脂蛋白代谢、保肝、泻下、抗癌等功能。临床上以虎杖为主药的制剂种类繁多。虎杖有效成分含量测定的报道也日益增益3~9]。本实验建立了虎杖药材及其提取物中白藜芦醇、大黄素、虎杖苷同时测定的非水电堆积毛细管电泳的分析法，方法专一性强、灵敏高，可有效监测药材质量及提取物中的成分含量变化情况，尚未见有文献报道。 本文采用毛细管电泳在线样品浓缩技术-电堆积富集技术，极大的提高了毛细管电泳分离测定的灵敏度。由于这3种被测物在水中的溶解度低，为了获得更好的堆集效果，采用非水毛细管电泳 技术进行分离测定。首次研究了电堆积-非水体系毛细管电泳紫外检测法同时分离测定中药虎杖中的有效成分大黄素、白藜芦醇和虎杖苷。选择甲醇作为非水溶剂，30 mmol/L 乙酸钠-4 mmol/LNaOH2 mmol/L CTMAB 为背景电解质，用紫外检测法，在220 nm处进行测定，成功的建立同时分离测定大黄素、白藜芦醇和虎杖苷的电堆积-非水毛细管电泳的新方法。该法快速、准确、重现性好、干扰少，检出限低，应用于中药虎杖中大黄素、白藜芦醇和虎杖苷的测定，富集倍数可以达到8倍。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 ACS2000 型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)、负电源：电压0~30kV可调；未涂层熔融石英毛细管中75 um，总长63 cm，有效长度45 cm。 大黄素、白藜芦醇和虎杖苷对照品(中国药品生物制品检定所)。虎杖为柳州市售。水为二次水。 ( *u 收稿日期：2008-03-05；修订日期：2008-06-10 ) ( 基金项目：广西自然科学基金(桂科自0146001)和广西教育厅科学研究基金(桂教科[2000]392)项目资助 ) ( 作者简介：李利军(1966-)，男，教授； Email： lilijun0562 @sina. com ) 1.2 电泳条件 -25kV；重力进样高度；11cm；进样180s；波长220 nm；255℃；30 mmol/L NaAc-4 mmol/LNaOH2 mmol/L CTMAB；甲醇为溶剂。 1.3 实验方法 1.3.1 毛细管的处理 每天实验前依次用1mol/L NaOH溶液、二次蒸馏水、甲醇分别冲冼10min， 进样前用缓冲液冲洗30 min，实验3h后更换缓冲液。实验结束后用水冲洗，并用水浸泡过夜。实验所用的溶液进样前均用0.45 um 的滤膜过滤，并经超声波脱气30 min。 1.3.2 样品预处理 取中药虎杖10g干燥至恒重，中草药粉碎机粉碎成粉，过380um 筛后准确称取虎杖粉末0.5000g，加入15.00 mL 甲醇溶液，超声提取90min， 放冷至室温，冷浸12h后过滤，收集滤渣，滤渣用10mL甲醇超声提取60 min 后过滤，合并两次滤液，用0.45 um滤纸过滤后取5.00mL，定容至25.00mL。待测备用。将提取后的滤渣再用10mL甲醇提取，在选定条件下做电泳谱图，并未见有样品峰出现，因此说明样品已基本提取完全。 1.3.3 标准贮备液的配制 准确称取大黄素对照品0.0072g，配制成720 ug/mL 的对照品贮备液；准确称取白藜芦醇0.0064g，配制成640 pg/mL 的贮备液；准确称取虎杖苷0.0196 g，配制成784ug/mL的贮备液；上述溶液均用用甲醇溶解，0.45um 滤纸过滤，超声脱气，置冰箱4℃保存。 2结果与讨论 2.1 分离条件选择 2.1.1检测波长的选择 实验以甲醇为参比液，对被测物在200~400 nm 波长之间进行扫描，3种物质在220 nm处附近均有较强吸收，因此实验选取220 nm作为检测波长。 2.1.2 分离电压的选择 实验考察了电压为-18~-28 kV时的试验效果。实验结果表明，电压较低时，基线稳定，随着电压的增加，样品的分析时间缩短。当运行电压为-25 kV时，3种被测物质的分离度比较高，分析周期短；为保证较短的分离时间、较高的柱效，防止基线漂移、降低噪音，综合考虑选用-25 kV 作为分离电压。 2.1.3 缓冲体系的选择 本实验选择甲醇为缓冲液溶剂。 支持电解质浓度的影响：本实验考查了 NaAc从20~40 mmol/L对实验结果的影响，结果表明随着 NaAc 浓度增加，3种被测物出峰时间先缩短后延长，当NaAc 浓度为30 mmol/L时，大黄素、白藜芦醇和虎杖苷均在15 min 内出峰，峰形良好，柱效高，分离度高。因此选择NaAc浓度为30mml/L。 NaOH浓度影响：在本实验中，pH对3种被测物质的峰形、峰分离度起着决定性的作用，本实验考察了0~5 mmol/L NaOH浓度对迁移时间的影响。随着NaOH浓度的增加，3种有效成分出峰时间逐渐提前，实验表明在NaOH浓度为4mmol/L时，分离度较好、柱效较高，分析时间较短。因此实验选择以加入 NaOH 浓度为 4 mmol/L 时为最佳pH。 CTMAB 浓度的影响：添加适当的表面活性剂可以优化分离，改善电渗流和提高检测灵敏度。本实验选择十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)作为表面活性剂，考察了 CTMAB 的加入量对体系分离检测效果的影响。随着 CTMAB 量的加入，峰形有所改善，出峰时间提前，灵敏度提高，但是较高浓度的 CTMAB 会增加电流，使基线噪音增大。综合比较，选择 CTMAB 的浓度为2 mmol/L. 2.1.4 电堆积富集条件的选择 分析物溶剂对分离和样品堆集的影响：本实验考察了进样时间为30s时，用未稀释的电泳缓冲液、稀释1倍和4倍电泳缓冲液、纯甲醇稀释对照品储备液对峰形的影响。结果表明，随着浓度的降低，峰形逐渐变锐。因此用纯溶剂稀释被测物储备液得到的峰形要比用电泳缓冲溶液稀释时好，其峰高响应值最大，故本实验选用甲醇稀释储备液. 进样时间对富集倍数及分离的影响：本实验考察了进样时间对大黄素、白藜芦醇和虎杖苷甲醇溶液测定的影响。实验结果表明，在20~200s内，3种被测物质的响应信号与进样时间显现出较好的线性，大黄素： Y=6.824X+80.428(r=0.9963)；白藜芦醇：Y=57.731X-128.35 (r=0.9994)；虎杖宅： Y=80.403X+15.289(r=0.9992)。但是，随着进样时间的延长，由于层流现象，峰变宽严重，分离度下降。综合考虑检测灵敏度和分离度，选用进样时间为180 s。电堆积富集因子用公式 SE峰高=H堆集/H或 SE峰面积=A堆集/A计算为8. 2.2 线性关系的考察 配制大黄素、白藜芦醇和虎杖苷标准溶液，在试验的条件下，对3种被测物质的平均峰面积 与质量浓度(ug/mL)计算线性方程及相关系数，结果见表1。 表1 大黄素、白藜芦醇和虎杖苷的回归方程、相关系数及检出限 Tab.1 The results of regression equations， working curves and detection limits for emodin ， resveratroland resveratrol-3-O-β-D-glucoside 化合物 回归方程 相关系数 r 线性范围p/(ug/mL) 检出限 p/(ug/mL) 大黄素 Y=2036.7p-179.49 0.9999 0.49~72.0 0.054 白藜芦醇 Y=6845.5p-339.05 0.9996 0.80~64.0 0.069 虎杖苷 Y=6728.7p+381.97 0.9992 0.45~39.2 0.12 2.3 稳定性试验 取上述对照品溶液，每隔1h进样，连续10h，结果10h内大黄素、白藜芦醇和虎杖苷的峰面积积分值基本稳定，峰面积的RSD分别为2.1%、3.5%和4.3%(n=7)。 2.4 样品的测定及加标回收实验 配制大黄素、白藜芦醇和虎杖苷标准溶液，在试验的条件下，对3种被测物质和样品进行测定，见图1。我们用本方法对样品进行测定，将虎杖提取液，在上述实验条件下平行测定5次，经计算，在虎杖提取液中大黄素、白蔡芦醇和虎杖苷的含量分别为0.54、0.67、2.41 mg/g。并按照以上实验方法进行回收率实验，其结果见表2。 图1 样品和对照品的电泳谱图 Fig.1 Electrophorograms of the sample and the standard(a) 样品；(b)对照品 1-大黄素；2-白藜芦醇；3-虎杖苷 电泳条件：30 mmol/L NaAc； 4 mmol/L 的 NaOH； 2 mmol/L CTMAB；电压：-25kV；波长：220nm；温度：255℃ 表2 回收率实验结果 Tab.2 Results of recovery tests 分析物 物质含量 RSD/% 平均回收率 /(mg/g) (n=5) /% 大黄素 0.54 2.9 98.6 白藜芦醇 0.67 2.3 99.5 虎杖苷 2.41 4.1 101 由表2，可知大黄素的回收率均在95.8%~102%之间，白藜芦醇的回收率在98.2%~102%，虎杖丈的回收率在98.8%~103%。其 RSD 均小于5.0%。可见该方法具有较好的重现性和理想的准确度，可应用于中药虎杖中大黄素、白蔡芦醇和虎杖苷的测定。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 王忠壮，胡晋红.现代中药学.上海：第二军医大学 出版社，2006.344 ) 2] 朱立贤，金征宇，陶冠军.中成药，2005，27(8)：9444 ( 刘树兴，程丽英.食品科技，2005，(2)：96 ) ( 周建军，张宏杰，杨培君.中药材，2005，28(1) ： 31 ) ( 王京霞，许家鸾，朱新颜.中国实验方剂学研究， 2005，11(3)： 1 7 ) ( 粱广华，张建浩.中药材，2005，28(9)：784 ) ( 7] 伍晓春，陆 豫.中医药学刊，2005，23(9)： 1644 ) 口B ( 杨红美，陈 波，曾建国等.中国中药杂志，2006， 31(3)：202 ) ( 91 倪网东，满瑞林，李志明等.化学工程师，2006， (2) ： 37 ) ( 101 Albin M， Grossman P D， Moring S E. Anal Chem，1993， 65：489A ) 「111]徐木生，王小如，杨凡原.色谱，1998，16(4)： 309 Studies on separation and determination of three extracts in polygoni cuspidati with sample stackingnon-aque-ous electrophoresis LILi junn**，1 wU Feng min3， LI Si-guang， YU Lai-bo’ and WU Jian ling (1. Department of Biological andChemical Engineering ， Guangxi University of Technology， Liuzhou 545006； 2. Department of Chemical Engineeringand Pharmacy， Henan University of technology， Luoyang 471003； 3. College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530005)， Fenxi Shiyanshi ， 2009， 28(4)：55~58 Abstract ： A new method for the simultaneous determination of emodin、 resveratrol and resveratrol-3-O-B-D-glucosideby stacking non aqueous capillary electrophoresis had been proposed. The operating buffer was composed of 30 mmol/Lsodium acetate-4 mmol/L sodium hydroxide-2 mmol/L CTMAB in methanol. The applied voltage was -25 kV and theUV detection wavelength was 220 nm. This method is simple ， rapid and accurate. It had been successfully used forthe determination of three extracts in polygoni cuspidati. Key words ： Non-aqueous capillary electrophoresis； Sample-stacking； Emodin； Resveratrol； Resveratrol-3-O-β-D-glu-coside； Polygoni cuspidati nki —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net