芳香族羧酸中水杨酸、对氨基苯甲酸、苯甲酸等分离检测方案(毛细管电泳仪)

分析科学学报JOURNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE2008年8月Aug. 2008第24卷第4期Vo1.24 No.4 第4期李 佗等：芳香族羧酸的毛细管电分离测定方法研究第24卷 文章编号：1006-6144(2008)04-0377-04 芳香族羧酸的毛细管电泳分离测定方法研究 李 佗，阎宏涛*，郭艳丽 (西北大学化学系，西安710069) 摘 要：建立了一种分离测定8种芳香族羧酸的新方法。实验优化了分离测定条条，以pH10.0的含有10 mmol/Lβ环糊精的硼砂缓冲溶液(10mmol/L)作为电泳缓冲液，工作电压25kV，检测波长214 nm，9 min 内实现了8种族香族羧酸的基线分离，芳香族羧酸在5~120 ug/mL 范围内呈良好的线性关系，其相关系数在 0.9967 到0.9992之间。该方法高效、快速、简便，应用于药物足光散中苯甲酸和水杨酸的分析，结果满意。 关键词：毛细管电泳；芳香族羧酸；β-环糊精；分离测定 中图分类号：O657.8 文献标识码：A 芳香族羧酸是一类重要的有机化合物，在食品、药物等生产中有着很重要的应用。已报道的芳香族羧酸的测定方法有液相色谱法[1，2]气相色谱法去3]和毛细管电泳法[4，5]等。毛细管电泳法具有高效、快速和样品用量少等特点，已应用于芳香族羧酸的测定。吕元琦等[4]建立了一种β-环糊精修饰的区带毛细管电泳分析苯甲酸、硝基苯甲酸和羟基苯甲酸的方法。Yu等等51考察了离子液体作为添加剂对苯甲酸及其取代物分离的影响，表明阳离子液体对分离度影响显著，而阴离子液体则对分离度无明显影响。 苯甲酸、氨基苯甲酸、羟基苯甲酸等8种芳香族羧酸的毛细管电泳分离分析目前未见报道。本文采用毛细管电泳法进行了苯甲酸等8种芳香族羧酸的分离和测定研究。讨论了β环糊精浓度、酸度、缓冲液浓度以及工作电压等对分离测定的影响，优化了测定条件。结果表明，在环糊精的包结作用下，可以有效地提高8种芳香族羧酸的分离度。研究并建立了一种毛细管电泳法分离分析苯甲酸等8种芳香族羧酸的新方法。该法应用于药物足光散中苯甲酸、水杨酸含量的测定，结果满意。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 CL1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)；50 cm X50 umi.d.石英毛细管(河北永年光纤厂)，有效长度42 cm。 β-环糊精(β-CD，天津市巴斯夫化工有限公司)，苯甲酸，邻氨基苯甲酸，间氨基苯甲酸，对氨基苯甲酸，水杨酸，间羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸，2，4-二羟基苯甲酸均为分析纯。分别称取一定量的苯甲酸、邻氨基苯甲酸、羟基苯甲酸等8种芳香族羧酸，配制成1.00 mg/mL 的标准储备液。实验中移取一定量的不同羧酸储备液，配制成一定浓度的混合标准溶液。硼砂为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。 足光散为市售药品。 1.2 毛细管处理及电泳条件 实验前分别采用0.1mol/L的NaOH和二次蒸馏水冲洗毛细管各5 min ，然后再用缓冲液冲洗5min后进行分离测定。实验中，每两次运行之间用缓冲液冲洗3 min. 缓冲液：10 mmol/L 硼砂和10 mmol/L β-CD(pH 10.0)；工作电压25kV；检测波长214 nm；进样方 ( 收稿日期：2007-10-08 修回日期：2007-12-11 ) ( 基金项目：陕西省自然科学基金(No.2007B01) ) ( *通讯联系人：阎宏涛，男，博士，教授，研究方向：光谱分析、分离科学. ) 式：高度度样(10 cm) ，进样时间：15s. 2 结果与讨论 2.1 β-CD对分离的影响 实验探讨了β-CD对上述8种芳香族羧酸分离度的影响，结果如图1所示。表明一定量的β-CD的存在，可以有效地改善分离度。从图1可见，B-CD 的存在与否，8种芳香族羧酸的分离效果明显不同。在p H 9.0 10 mmol/L 硼砂缓冲液条件下，8种物质不能全部实现基线分离。即使改善缓冲溶液的酸度、浓度和分离电压仍不能全部达到基线分离。但当加入10 mmol/L B-CD 于 10 mmol/L硼砂缓冲液后，8种物质的分离度得到很大的提高(图1b)。然而由于β-CD对不同芳香族化合物的包结选择性差异的缘故16]，图1b中8种芳香族羧酸的毛细管电泳峰顺序与图la不一致。 图1 不同缓冲液的毛细管电泳图 Fig.1 Electropherogra ms with different buffer solution a：10 mmol/L tetraborate buffer，p H 9.0， 20 kV； b：10 mmol/L tetraborate buffer， 10 mmol/L B-CD，pH9.0，20 kV.1. paminobenzoic acid， 2. nraminobenzoic acid，3. oaminobenzoic acid， 4. benzoic acid， 5. nhydroxybenzoic acid， 6. Salicylic Acid， 7.phydroxybenzoic acid， 8.2 ，4-dihydroxy benzoic acid. 对于所分析的8种羧酸而言，不同羧酸的取代基及其结构差异，β-CD与客体分子，即不同芳香族羧酸的包结作用亦不同。pH9.0溶液中，水杨酸处于一级电离(pKai12.38)，生成的水杨酸阴离子容易进入β-CD的疏水空腔，并且其苯环上的羟基可以与β-CD分子边缘上的羟基形成氢键，所以反映在图1b中水杨酸的迁移时间较快，峰位置在前。而间、对羟基苯甲酸，2，4-二羟基苯甲酸由于发生了二级电离，所产生的二价阴离子不易进入β-CD空腔，也难与β-CD分子上的羟基形成氢键，故迁移较慢，在图1b中出峰的顺序偏后。而氨基苯甲酸和苯甲酸仅只是羧基发生了电离，较易进入进-CD空腔，但因其与β-CD边缘上的羟基形成氢键难易程度不同的缘故，故其峰位置在水杨酸和间羟基苯甲酸之间(图1b)。实验中中择加入一定量的β-CD于缓冲液中，以提高分离度。 2.2 B-CD浓度的影响 选择不同浓度(5~20 mmol/L)的β-CD进行8种芳香族羧酸分离。结果表明，β-CD浓度过低或过高，均使得芳香族羧酸的迁移速率发生变化，分离度下降。在低浓度β-CD 存在下，水杨酸和对氨基苯甲酸、苯甲酸和间氨基苯甲酸相互竞争进入β-CD内腔，使得迁移时间相同，峰重叠，从而分离度下降；在高浓度时是由于β-CD的加入，溶液粘度改变，从而引起分离度的变化16]。所以实验中选择缓冲液中加入浓度为10 mmol/L的B-CD。 2.3 缓冲液酸度的影响 缓冲液的酸度不但直接影响芳香族羧酸的带电性，而且影响β-CD分子与其的包结程度，从而影响其分离度。实验考察了在不同pH条件下，8种芳香族羧酸的分离结果。结果表明，pH小于8.0，各芳香族羧酸不能达到基线分离，且出峰顺序也发生变化。随着pH的进一步增大，芳香族羧酸的分离度随之增大，分离时间亦随之增加。这是由于缓冲液pH影响芳香族羧酸的二级电离度p Kaz 的缘故。8种芳香族羧酸中，邻、间、对羟基苯甲酸的 p Kaz 均大于9(分别为12.38、9.859.23)，而邻、间对氨基苯甲酸的 pKaz 均小于5(分别为4.79、4.79、4.85)，pH小于8.0时上述芳香族羧酸的羟基和氨基均未电离，可能因羟基与B-CD上的羟基易形成氢键，故迁移较快，但分离度下降。综合考虑，实验选择pH为10.0的硼砂缓冲溶液，以获得好的分离度。 2.4 缓冲溶液浓度的影响 试验了不同浓度硼砂缓冲液对分离度的影响。结果表明，随着缓冲液浓度的增加，芳香族羧酸的迁移时间也随之增加。当缓冲液浓度小于5 mmol/L时，芳香族羧酸分离变差；缓冲液浓度高于15 mmol/L，电流变大，焦耳热增大，导致2，4-二羟基苯甲酸峰变宽，并且分析时间随之增加。实验选择10 mmol/L的硼砂缓冲液。 2.5 工作电压的影响 工作电压是控制分离度、分析时间的重要因素。在上述实验条件下，考察了电压对分离的影响。随着工作电压升高，分析时间缩短，但工作电压过高时，导致焦耳热过大，引起淌度增加，柱效和分离度降低’。实验选择工作电压为25kV。 2.6 线性范围、重现性和检出限 在上述实验条件下，苯甲酸等8种芳香族羧酸在9 min内实现了基线分离，结果见图2. 以峰面积与对应的浓度制作标准曲线，求得8种芳香族羧酸的线性关系和相关系数。以3倍信噪比计算其检出限，结果如表1所示。 图2 优化条件下的毛细管电泳图 Fig.22Electropherograms at the optimized con-dition 10 mmol/L tetraborate buffer； 10 mmol/LBCD；pH10.0；25 kV. 1. paminobenzoic acid， 2. nraminobenzoic acid，3.oaminobenzoic acid，4. benzoic acid， 5. nrhydroxy-benzoic acid， 6. Salicylic acid， 7. phydroxybenzoicacid， 8.2，4-dihydroxy benzoic acid. 表1 检出限和线性方程 Table 1 The detection limits and regression equations Compound Linear range Regression equation Correlation coefficient Detection limit (ug/mL) (ug/mL) Salicylic acid 5~100 v=263.02x+418.04 0.9985 1.00 pAminobenzoic acid 5~120 y=86.05x+419.95 0.9992 0.92 Benzoic acid 5~120 v=283.22x+584.21 0.9984 0.90 mAmino benzoic acid 5~120 y=724.72x+1786.9 0.9991 0.33 o Aminobenzoic acid 5~120 y=701.61x+211.86 0.9983 0.39 m Hydroxybenzoic acid 5~100 y=900.31x+5026.7 0.9967 0.30 pHydroxybenzoic acid 5~100 y=526.81x+1209.1 0.9988 0.54 2.4-Dihydroxy benzoic acid 5~100 v=874.36x+1120.4 0.9988 0.34 连续5次进样分离测定，水杨酸、对氨基苯甲酸、苯甲酸、间氨基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸和2，4-二羟基苯甲酸的迁移时间的相对标准偏差分别为0.92%、1.10%、1.07%、1.08%1.09%2.37%、1.95%、1.85%；峰面积的相对标准偏差分别为3.81%4.84%4.07%、4.26%、3.66%4.24%2.28%2.11%。 样品分析 2.7.1 市售药品分析 准确称取药物足光散(含有苯甲酸和水杨酸)0.50 g，加入20 mL 水，沸水浴加热20 min 溶解，过滤，滤液定容于50 mL 容量瓶中。再准确移取1mL 定容至 50 mL容量瓶中。在上述实验条件下进行分离和测定并进行回收率实验。结果见表2。 表2足光散中苯甲酸和水杨酸的含量及其回收率(n=3) Table 2 The content of benzoic acid and salicylic acid in zuguangsan and the recovery ( n=3) Compound Determined Added Found Recovery(%) RSD(%) (%) (ug) (ug) Benzoic acid 6.52 10.0 9.78 97.80 0.75 Salicylic acid 9.29 10.0 9.82 98.20 1.13 2.7.2卫人工合成样品分析 取一定浓度8种芳香族羧酸合成样品，进行分析，结果见表3。 表3样品分析结果(n=3) Table 3The results of sample (n=3) Compound Determined(ug/mL) Real content (ug/mL) RSD(%) Salicylic acid 9.4 78.9 10.0 80.0 1.2 2.3 pAminobenzoic acid 9.8 79.3 10.0 80.0 2.3 1.9 Penzoic acid 10.2 80.9 10.0 80.0 1.8 3.5 mrAminobenzoic acid 10.4 79.2 10.0 80.0 1.5 2.7 cAminobenzoic acid 9.7 81.2 10.0 80.0 3.0 4.3 nr Hydroxybenzoic acid 9.2 81.4 10.0 80.0 2.7 2.2 p Hydroxybenzoic acid 10.5 79.5 10.0 80.0 1.6 2.8 2.4-Dihydroxy benzoic acid 10.6 81.1 10.0 80.0 2.0 2.2 3 结论 本文建立了β-环糊精修饰的毛细管电泳分离8种芳香族羧酸的新方法。研究表明，在β-环糊精的存在下，8种芳香族羧酸可以实现基线分离。该方法快速、准确、样品消耗量少，已成功应用于实际样品的测定，取得了满意结果。 ( 参考文献： ) ( [1] WAN GJing xin(王静馨) ，XIANG Xuzhang(项续章). 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Beijing(北京)：Science Pres(科学出版社)，1995：52. ) Studies on the Method for Separation of AromaticAcids by Capillary Electrophoresis LI Tuo， YAN Hongtao*， GUO Yan-li (Department of Chemistry， Northwest University， Xi'an 710069) Abstract ： A novel method for the separation of eight aromatic acids was developed. The running buffer consistsof 10 mmol/L tetraborate (pH 10.0) and 10 mmol/L β-CD. The applied voltage was 25 kV and the detectionwavelength was 214 nm. The eight aromatic acids were completely separated and determined within 9 min. Thelinear relations were from 5 ug/ mL to 120 ug/ mL and their correlation coefficients (r) were between 0.9967 and0.9992. The method was rapid， simple and effective. It has been applied to the determination of the content ofbenzoic acid and salicylic acid in zuguangsan with satisfactory result. Key words ： Capillary electrophoresis； Aromatic acids； B-CD； Separation and determination China Academic Journal Electronic Publishing House. 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