间苯二酚、邻苯二酚等六种苯的取代物中主要成分含量分析检测方案(毛细管电泳仪)

维普资讯 http：//www.cqvip.com2004年第1期新疆化工37 毛细管电泳法快速分离检测六种苯的取代物 王 昕 (新疆化工学校，北京彩陆科学仪器有限公司) 摘 要：采用高效毛细管电泳法(HPCE)对6种苯的取代物进行了快速分离；通过实验考察了运行缓冲溶液的种类、酸度、浓度、工作电压对分离的影响；选择了最佳实验条件形成标准方法用于北京彩陆科学仪器有限公司校准毛细管电泳仪各项检测参数(灵敏度、稳定性、检测限等)。 关键词：高效毛细管电泳；紫外检测；电渗流；基线分离 1 前言 高效毛细管电泳(High-Performace Capil-lary Electrophoresis， HPCE)是荷电粒子或离子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度和分配系数的不同进行分离的一种微柱分离技术，由于其具有较高的分离效率、高选择性、分析速度快、样品和试剂用量少、对环境的污染程度低、分离模式和检测方法多样化等优点，受到越来越多的分析化学家的青睐。也已广泛应用于生命科学、遗传工程、药物分析、临床医学及化工、食品、环境检测等领域。 高效毛细管电泳分离根据其不同的分离特性可分为毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、胶束电动毛细管色谱(MECC)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管电色谱(CEC)等6种分离模型，而目前研究最多，应用最广的是为毛细管区带电泳。本文即采用毛细管区带电泳(CZE)分离对硝基苯甲醛、间苯二酚、邻苯二酚、对硝基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对硝基酚等6种苯的取代物，由于这6种物质均在紫外有较强吸收，所以采用紫外吸收光谱法进行检测。通过实验考察了运行缓冲溶液的种类、浓度、pH值及工作电压对分离的影响，选择了合适的实验条件，使得该6种混合物在 12min 内 得到完全分离。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 CL2001型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)：石英毛细管50um(i，d)，有效长度40cm(河北永年光纤厂)；对硝基苯甲醛、间苯二酚、邻苯二酚、对硝基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对硝基酚均为分析纯：所有溶液均用高纯水配制； N2000色谱数据工作站(浙江大学智能信息工程研究所)。 2.2 实验方法 连接好电泳仪与紫外检测装置，毛细管依次用0.1mol/L NaOH、水和运行缓冲溶液冲洗30min，所有溶液需经超声波除气，并用0.45um微孔滤膜过滤。采用阳极端手动压差进样，在选定的实验条件下进行分离，每两次运行之间用运行缓冲溶液冲洗中细管 2min，分离进行5~6次后，更换两边缓冲溶液。 毛细管电泳工作条件：检测波长270mm；运行缓冲溶液 20mmol/L硼砂(使用硼酸或氢氧化钠调节pH=9.2)；分离电压20kV；重力进样 10cm，10s；室温检测。分别对上述6种样品溶液进行紫外停留扫描寻找其最大吸收波长，综合所有情况选择270nm 作为检测波长。 当混合标准样品的各组分达到基线分离 时，分别提高单组分物质的浓度，根据其峰高的变化来定性。 3 结果讨论 3.1 缓冲溶液的选择 分别配置 NazHPO4-NaH，PO4、KHPO4-KHPO4、Na2B407-HB03、NazHPO4-硼砂、硼砂等五种缓冲溶液，进行电泳实验考察各缓冲溶液对分离的影响，结果发现其他几种溶液样品无法实现基线分离，个别样品灵敏度较差，本实验选择 NazB407-NaOH 溶液为缓冲体系作进一步研究。 3.2缓冲溶液酸度的影响 毛细管电泳是在电场作用下带电粒子在毛细管内的定向移动，溶质在给定时间间隔和给定电场下移动的距离用淌度表示，而淌度受到缓冲溶液 pH的影响显著，因此缓冲溶液 pH的调节和控制是优化分离的重要因素。通过考察pH在7~11时对分离的影响，发现 pH越低，电渗流越小，样品迁移时间越长，对硝基苯甲酸峰形较差，拖尾严重； pH越大，产生的焦耳热越大，毛细管中容易出现气泡致使实验中断，本实验选择9.2作为缓冲溶液的酸度获得了满意的结果。 3.3 缓冲溶液浓度对分离的影响 缓冲溶液浓度对分离度产生明显的影响，配置硼砂溶液的浓度分别为10、20、30、40mmol/L，查看6个组分的分离情况，发现随着浓度的增加毛细管内的电流增大焦耳热增加，造成毛细管内的液体温度梯度，从而影响分离效果，电流增加还导致基线噪音增大，严重时在管内产生气泡，阻断电流，而浓度若太低时则电流较小，样品的迁移时间延长却无法完全分离，本文选择了30mmol/L的硼砂溶液，6种样品在 12min 内达到了基线分离，其理论塔板数在3万以上，个别组分达到了50万。 3.4工作电压的影响 工作电压对分离速度、分离度均产生影响。增加电压可以提高分离效果，缩短分离时间，但是工作电压增加，管内电流增加，基线噪音增加。本实验以 30mmol/L的硼砂溶液为运行缓冲溶液，分别在10、15、20、25kV下分离6种标准样品，其迁移速度随工作电压的降低而减慢，迁移时间延长会引起谱带的展宽，各组分未能完全分离，而在高电压下，组分迁移快且峰扩展变小，柱效高，但不能忽略焦耳热带来的影响，同时使迁移时间的重现性变差，综合以上结果本次实验选择20kV 作为分离工作电压。 检测波长：270nm，进样时间 10s，进样高度 10cm，分离电压 20kV，缓冲溶液为30mmol/L硼砂，50um(i，d)毛细管，有效长度 40mm。 3.5 重现性实验 混合标准试样在选定的条件下重复进样10次，各组分迁移时间和峰面积的相对标准偏差平均值见表1。同时配置标准系列浓度的标准试样，以峰面积和对应的浓度做工作曲 线，求得其线性关系和相关系数，再根据公式：D=3CN/H计算最小检测限，其中，C为标样浓度，N为噪音高度，H为标样峰高。其回归方程及检测限见表2。 表1 迁移时间和峰面积的重现性 迁移时间 峰面积 平均值 RSD% 平均值 RSD% 对硝基苯甲醛 3.89 0.84 5128 2.49 间苯二酚 5.12 0.94 4987 2.75 邻苯二酚 8.15 0.81 8547 2.76 对硝基本苯甲酸 8.78 0.79 11690 3.30 对氨基苯甲酸 9.07 0.72 7955 2.49 对硝基酚 9.94 0.71 6574 2.66 表2回归曲线和检测限 回归方程(Y=AX+B) 相关系数(Y) 检测限(mg/L) 对硝基苯甲醛 A=3.62E-003 B=9.97E-002 0.9948 1 间苯二酚 A=1.37E-002 B=1.18E+001 0.9969 2 邻苯二酚 A=5.85E-003 B=1.10E+001 0.9995 3 对硝基本苯甲酸 A=1.72E-003 B=1.85E+000 0.9978 1 对氨基苯甲酸 A=2.21E-003 B=3.47E+000 0.9990 1 对硝基酚 A=8.46E-003 B=3.58E-001 0.9959 2 ( 参考文献 ) ( [1]傅小芸，吕建德.毛细管电泳[M]，浙江：浙江大学 出版社，1997. ) ( [2]陈义.毛细管技术及应用[M]，北京：化学工业出版 社，2000. ) ( [3]林炳承.毛细管电泳导论[M]，北京：科学出版社， 1996. ) ( [4]邓延倬，何金兰.高效毛细管电泳[M]，北京：科学 ) ( 出版社，2000. ) ( [5]王明义，罗国安.色谱，1996，3(14)，111-112. ) ( [6]张裕平，袁倬倬.分析实验室，2001，11(增刊)，129 -130. ) ( [7]韦寿莲，莫金恒，郑一宁.分析化学，2003，2(31)， 225-228. ) ( [8]李忠，刘国诠，陈义.高等学校化学学报，2001，22 (10)，1654. )