苯二酚异构体溶液中主要成分含量分析检测方案(毛细管电泳仪)

第24卷第1期2005年1月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.24.No.12005-1 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第24卷第1期2005年1月Vol.24.No.12005-1 毛细管电泳柱端安培检测装置的研制 周文峰，袁倬斌 (中国科学院研究生院应用化学研究所，北京100039) 要：研制了一种新型的毛细管电泳柱端型安培检测装置。以直径为6um的碳纤维微电极为工作电极，在自组装的ACS-2000毛细管电泳仪上，考察了用不同内径毛细管分离时分离电压对背景噪声的影响，利用该装置同时测定了3种苯二酚的异构体。 关键词：毛细管电泳；安培检测池；研制 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2005)01-0088-03 高效毛细管电泳(HPCE)是分析化学新兴的前沿技术之一，目前，HPCE 已经广泛应用于生物分子、无机离子、有机分子等的分离分析，并在实际中应用于药物分析、临床分析等多个方面。检测器是HPCE发展的关键领域。HPCE 的检测器必须具有灵敏、响应快的性能。从1987年 Ewing 等2首次将电化学检测技术用于高效毛细管电泳后，电化学检测特别是安培检测法已成为高效毛细管电泳中有吸引力的检测技术之一，受到了广泛的重视。但由于高压电场的作用，分离电流比检测池中测量的电化学电流高几个数量级，它的微小波动都会给电化学检测带来非常高的噪声水平(分离毛细管直径大于25pm)，因此，如何有效的消除或降低来自分离电压的噪声干扰是安培型电化学检测器设计的一个重要任务。 近年来，围绕如何降低来自分离电压的噪声影响，人们设计了多种检测系统[3~15]，各有其优缺点。目前，HPCE安培检测装置有离柱、柱端、柱上等类型。由于离柱型安培检测装置需要隔离分离高电压的接头，尽管制作接头的方法一再被简化，但比起无接头的毛细管来说还是复杂些。而柱端检测系统结构简单、制作方便。Lul6] 及 Huang等'7的研究证明，当毛细管的内径<25um时，分 离电场对电化学检测的背景噪声影响可以忽略。本文设计了一种 HPCE 柱端安培检测系统，可以简单方便地消除分离电压对检测的影响，采用显微操作装置方便地安装并固定工作电极，在降低背景噪声的同时，提高了灵敏度，对几种苯二酚异构体进行了分离。 实验部分 1.1 仪器与试剂 自组装毛细管电泳检测系统(中国科学院研究生院应用化学研究所)；ACS-2000 安培检测器(中国科学院研究生院应用化学研究所)；CHI660A电化学系统(美国 CH Instruments)；无涂层弹性融硅毛细管狂(25 um、50 pmi.d.，375 um o.d.，有效长度分别为40 cm，河北永年光导纤维厂)；PHH90B型便携式酸度计(上海雷磁仪器厂)；电化学测量采用三电极系统，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，自制碳纤维微电极为工作电极。 HF、CuSO4、HC苯、对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、十二烷基硫酸钠β-环环精、KHPO4NaOH等试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 1.2 安培检测装置的制作 用有机玻璃制成如图1所示的安培检测装置，有机玻璃的大小为3 cm X0.5 cm X0.3 cm，在有机玻璃板中间竖直刻有凹槽，宽约0.1cm，中央小孔宽约0.2cm。毛细管用胶固定在凹槽槽，被HF 腐 ( * 收稿日期：2004-03-04；修订日期：2004-03-24 ) ( 基金项目：国家自然科学基金(29875027 ，20175025)、分析化学重点基金(20235010)、电分析化学国家重点实验室基金及“十五”科技攻关重大项目(2001BA210A04中的第七课题)资助项目 ) ( 作者简介：周文峰(1976-)，女，博士研究生 ) 蚀的开口端伸出在小孔位置。制成的碳纤维工作电极从凹槽另一端被固定，由于固定毛细管及工作电极的小孔处在同一条直线上，所以碳纤维工作电极可以很方便的插入分离毛细管而不碰壁。从小孔处引出的铂丝经板后绕出，可作为电泳的阴极。工作电极碳纤维电极上的工作电流由银丝引出。从检测池中可分别引出铂丝和银丝作为对电极及参比电极。 图1 安培检测装置示意图 Fig.1 Scheme of capillaryamperometric detection system 1-参比电极；2-辅助电极；3-柱端型安培检测装置；4-检测池；5-工作电极；6-负极；7-毛细管；8-羊品 1.3 碳纤维工作电极的制作 将单根长约2cm，直径为6um的碳纤维，分别用丙酮、去离子水洗涤，自然晾干后，将其一端在电镀装置中镀铜，镀完后将其镀铜端与一根长约6cm，直径为0.2mm的银丝焊接。将焊接好的银丝穿入一根长约5 cm，内径为0.25 mm的毛细管中，碳纤维伸出毛细管约1cm，银丝从毛细管另一端伸出，毛细管两端用环氧树脂密封，固化后即成一根碳纤维微电极。微电极的尺寸可根据需要截取，实验过程中长约0.1cm。每次使用前在0~1.0V范围内，循环扫描4~5次。 1.4 毛细管的前处理 毛细管在与微电极对接前应做一定的处理。先将毛细管分别用 HO冲洗 5 min， 0.1 mol/L HCl冲洗20 min、HO冲洗5 min、0.1 mol/L NaOH溶液冲洗30min、HO冲洗5min后，将其一端放到稀释的 HF 中浸泡12h，使管口形成喇叭口状。 1.5 实验方法 毛细管在每次使用前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸馏水及缓冲溶液冲洗，安培检测池均用缓冲溶液充满。 苯二酚电泳工作条件：20 mmol/L KHPO4-NaOH(pH 12.0)-25 mmol/L SDS-10 mmol/Lβ-环糊 精，经前处理，与工作电极对接接的的毛细管(25um、50 um ×40 cm)；分离电压20kV；采样电压20kV；采样时间10 s；Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，自制碳纤维微电极为工作电极，检测电压1.0V。所有溶液使用前均用孔径为0.45 um的滤膜过滤。所有实验均在室温下进行。 2 结果与讨论 2.1 工作电极插入毛细管长度对检测灵敏度的影响 目前电极与毛细管的对准方式主要有3种：A电极插入毛细管中B电极插入带喇叭口的毛细管中和C大面积电极。实验中对毛细管末端用 HF处理成喇叭口形，采用B方式。而A方式操作困难，电极容易碰壁，C方式灵敏度不高。随着工作电极插入分离毛细管内长度的增加，检测灵敏度随之增大，但基线噪声亦随之增大，试验过程中工作电极插入分离毛细管内约0.05 cm。 2.2 噪声水平 在上述实验条件下，分别使用内径为25 um 和50 pm 的毛细管柱端型安培检测试验，对于50m内径毛细管其噪声水平小于10 pA，对于 25 um内径毛细管其噪声水平小于1pA。由实验可知，在柱端型安培检测装置中，管径为25um时，分离电场对检测的背景噪声较小。 2.3 苯二酚异构体毛细管电泳柱端安培检测 在20 mmol/L KHPO4-NaOH25 mmol/L SDS-10mmol/Lβ-环糊精(pH12.0)的缓冲溶液中，分别使用无涂渍石英毛细管(25 um、50 um X40 cm)为分离毛细管，对苯二酚的三种异构体在20 min 内达到了完全分离。图2为苯二酚异构体的毛细管电泳分离图。 从图2中可以看出，当毛毛管内径为50 um时，其噪声水平明显大于25 um 内径时。受噪声水平较高影响，灵敏度降低。当毛细管外径相同，内径小时，在同样电压下，电流越小，产生的焦耳热量越少。另外，内径越小，表面积/体积比越大，散热效果越好，因此，分离效果也越好，出峰变慢。实验结果以内径为25 um的毛细管为佳。 2.4 苯二酚异构体的工作曲线及检出限 配制不同浓度的苯二酚异构体溶液，测其峰电流与质量浓度的关系，其工作曲线及检出限(S/N=3)列于表1、表2。实验表明，毛细管内径为25um时，线性范围宽、相关性好且检出限低。 图2 苯二酚异构体的毛细管电泳分离图 Fig.2 Electrophorograms of Hydroquinone， Resorcinol andCatechol 毛细管内径(a)25um； (b) 50 pm；实验条件：20 mmol/LKHPO4-NaOH(pH12.0)-25 mmol/L SDS10 mmol/L β-CD；1.对苯二酚(20 mg/L)；2.邻苯二酚(20 mg/L)；3.间苯二酚(80 mg/L) 表1 25 um 内径毛细管分离邻、间、对苯二酚的工作曲线及检出限(n=5) Eb.1 Working curves and detection limits of Hydroquinone，Resorcinol and Catechol (capillary i. d. 25 um) 线性范围 工作曲线 化合物 p/(mg/L) 邻苯二酚0.5~100 Y=0.45p+0.50 间苯二酚0.2~100 Y=0.62p+0.24 对苯二酚0.5~100 Y=0.45p+0.26 相关系数 检出限 p/(mg/L) 0.9992 0.2 0.9984 0.1 0.9988 0.1 表2 50 um 内径毛细管分离邻、间、对苯二酚的工作曲线及检出限(n=5) Eb.2 Working curves and detection limits of Hydroquinone，Resorcinol and Catechol (capillary i. d. 50 pm) 化合物 线性范围 工作曲线 相关系数检出限 p/(mg/L) p/(mg/L) 邻苯二酚 10~200 Y=0.66p+0.52 0.9987 3 间苯二酚 3~200 Y=0.46p+0.57 0.99915 2 对苯二酚 15~200 Y=0.24p+0.41 0.9993 2 ] 周伟红，吴明嘉，汪尔康.分析化学，1995 ，23(3)：3434 ( 2] Wallingford R A， Ewing A G. Anal Chem， 1 987 ，59：1762 ) ( 吴明嘉，许莉娟.分析化学，1995，23(5)： 604 ) ( 李关宾，杜 斌，金文睿.睿析化学，1995 ，23(4)：480 ) ( 5] 许丹科，华 林，陈洪渊.高等学校化学学报，1996，17 (5) ： 707 ) 6刘志明，由天艳，汪尔康.分析化学，1998，26(6)： 786 ( 7] 吴性良，方爱萍，张祥民.样谱，1999，17(2)：190 ) ( Voegel phillip D， B aldwin r i chard P . E l ectrophoresis， 1997 ，18(12- 1 3)： 2 267 ) ( [9] 胡 深，李培标，程介克.高等学校化学学报，1996，17 (5)：710 ) ( 101 HuaL， Tan S N. Anal Chim Acta ，2000 ，403( 1 - 2 )：179 ) ( 1111 Fu C， Wang L， F ang Y . Anal Chim Acta， 1999，391 (1)：29 ) ( [12] ] 袁倬斌，张书胜，邹 洪.分析测试仪器通讯，1997， 7(4)：198 ) ( [13] 袁倬斌，李向军，熊 辉.分析试验室，2001，20(3)：82 ) ( 141 赖 王，莫全垣，郑一宁.分析试验室，2002，21(5)： 72 ) ( [151 阮湘元，白 燕，冯德雄等.分析测试学报，2002，21 (4) ：48 ) ( 161 Lu W ，Cassidy R M. Anal Chem ，1994 ，66 ：200 ) ( [171 Huang X ，Zare R N，S l oss S e t al. A nal Chem， 1991 ，63： 141 ) ( Design of an end column a mperometric detec-tion system in capillary electrophoresi s (CE) Z HOU Wen feng a nd Y U AN Zhuo-bin (Applied Chemistry Insti-tute of the Graduate School of CAS，Beijing 100039)，Fenxi Shiyanshi ， 2005 ， 24 ( 1)：88~90 Abstract ：An e nd-column amperometric de t ection s y stem in CE was designed. T he detection cell was evaluated bythe determination of Hydroquinone， R e sorcinol a n d Cat-echol when 6 um C - fiber was u s ed as the w o rking elec-trode. Diferent i .d. capillaries were u s ed. ) Keywords ：Capillary electrophoresis； Amperometric de-tection cell； Design —Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.， Ltd.All rights reserved.