卷烟烟丝中亚硝胺类化合物检测方案(液质联用仪)

SPE-LC/MS/MS 快速测定卷烟烟丝中的烟草特有亚硝胺类化合物 李勇1，吴名剑1.2，练文柳2，度苏行1，陈东明1*，刘飞’ 1湘潭大学化学化工学院(湘潭411105) 2常德卷烟厂技术中心 (常德415000) 3热电(上海)科技有限公司 摘要： 建立了卷烟烟丝中烟草特有亚硝胺类化合物(TSNAs)的 SPE-LC/MS/MS分析方法，可一次性对卷烟烟丝中4种TSNAs 进行定量分析。该方法弥补了传统的烟丝中 TSNAs斤析方法样品处理步骤多，检测限高，适应范围窄等缺点。4种 TSNAs 的回收率的范围在95.7%~99.2%之间；相对标准偏差均小于8%；方法检测限均低于1.0ng/g。方法应用于国内外各类型卷烟的分析，得到理想的结果。 关键字：卷烟烟丝；烟草特有亚硝胺； SPE； LC/MS/MS 吸烟是引起肺癌及相关疾病的主要原因“。卷烟制品中含有大量潜在致癌物，而烟草特有亚硝胺类化合物(TSNAs) 是烟草制品中最主要的潜在致癌物质之一四。据报道，目前已鉴定出8种TSNAsB，其中最关注的4种为：N-亚硝基降烟碱(NNN)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱 (NAB)、4-甲基亚硝基吡啶基丁酮 (NNK)④。人们对 TSNAs 的致病机理进行了深入研究，发现 NNN及NNK 是强烈的动物致癌剂，它们能使动物活体和离体的人体组织中的DNA 甲基化，对遗传密码中带O°甲基鸟嘌呤的 DNA 产生化学损坏，从而引起肿瘤。在吸烟与健康被人们日益关注的今天，对卷烟烟丝中的 TSNAs 进行快速、准确的定量分析尤其显得必要。 烟草及烟草制品中 TSNAs 最经典的分析方法为气相色谱-热能分析仪 (GC-TEA) 法[6，7.8]。该法相对传统的 GC和 HPLC 更有更高的灵敏度。但是该法的样品处理十分复杂，对于分析烤烟等 TSNAs 含量极低的样品也存在 NAB无法检出的问题。近几年来，人们开始用 LC/MS/MS分析烟叶和烟气中的 TSNAs9.10.，11]。这些方法皆以混合型烟(如1R4F肯塔基标准烟)为基础建立。由于烤烟中 TSNAs 含量相对混合型烟要低得多，实验发现这些方法在分析烤烟时大多存在基质干扰严重， NAB 无法检出等问题。 本文利用OASIS 固相萃取纯化和富集样品，使得方法不但能更好地分析混合型卷烟，也能很好地分析烤烟，从而大大提高了方法的适应性。同时由于采用水溶液选择性提取分析物，样品处理步骤十分简单，分析速度大大提高。 1实验部分 1.1试剂与仪器 标样： NNN、NNK、NAT、NAB(多伦多研究化学品公司，加拿大)，纯度≥98%；内标： d4-NNN、d4-NNK(C/D/N位位素公司，加拿大)，纯度≥99%。 水为去离子水(R≥18MQ)；乙腈，色谱纯(MERCK公司，德国)；醋酸，色谱纯；醋酸铵，分析纯。 卷烟样品购自本地零售商店，使用前置于密封塑料袋 低温冰柜中保存。 液质联用仪： TSQ Quantum 三级四极杆质谱仪配Surveyor Autosampler 自动进样器、Surveyor LC pump液相泵、电喷雾离子源、Xcalibur 液质联用分析软件、Quantum Tune Master 质谱分析软件 (Thermo Scientific)；B3200S超声仪； MLI-Q-G去离子水仪； OASIS MCX (30mg)固相萃取小柱。 Sartorius 天平， d=0.0001g。 1.2样品处理 准确称量1.0烟丝，转入50mL锥型瓶，同时加入25uL 5000ng/mL 的内标混合液和10mL 去离子水。将锥型瓶盖好，置于超声震荡仪中在室温条件下恒温超声萃取 30 min。准确量取 4.0 mL 萃取液，加入10uL 1.0 mol/L的 NaOH 溶液将萃取液 PH 值调为碱性，碱性液上 OASISMCX(30 mg) 固相了萃取小柱。分析物用1.0 mL 甲醇洗脱下来，装入1.5 mL 液相进样小瓶，备定量分析。 1.3分析条件 液相色谱条件： Waters Symmetry Shield"MRP18 (150mm×3.9mm i.d.， 5um)色谱柱；进样量：3pL；柱温：50C；流动相：70%甲醇-30%水(添加0.1%的醋酸)，等度洗脱；流速： 0.25mL/min；运行时间：9.0min。 质谱条件：采用电喷雾离子化正离子扫描模式。具体质谱操作参数见表1。 TSNAs 的母离子和碎片离子选择见表2. 2.1色谱质谱条件的优化 色谱条件尝试了水-甲醇体系、水-乙腈体系以及添加乙酸的这些体系。发现70%甲醇-30%水(添加0.1%的醋酸)等度洗脱体系能较好地分离杂质同时得到对称的色谱峰形。 质谱条件的优化首先采用1.0 mg/L 的 NNN、NNK、NAT、NAB的混合标准溶液在正离子模式下进行母离子全扫描，确定NNN、NNK、NNK、NAB的分子离子 (178.1、208.1、190.1、192.1)信号稳定。然后按 QuantumTune Master 软件设置以 MS Only 的模式优化这几个分子离子的喷雾电压、鞘气压力、辅助气压力、离子转移管温度等离子源参数(见表1)，以MS+MS/MS 的模式寻找合适的碎片离子及其相应的碰撞能量(见表2)。每个分析物先选择2~3个碎片，再从中选取信号较强、质荷比较大、同时又无相互干扰的碎片定量。其余碎片可在有疑问时辅助定量。 表1质谱操作参数 操作条件 喷雾电压 3600V 鞘气压力 172Pa 辅助气压力 34Pa 离子转移管温度 350°℃ 碰撞气压力 0.2Pa 碰撞能量 10V 扫描时间 0.2s 质谱分辨率 0.7u 表 2 TSNAs 的母离子/碎片离子选择 分析物 母离子(m/z) 碎片离子(m/z) 碰撞能量(m/z) NNN 178.1 119.1 20 148.1 10 NAT 190.1 106.1 20 160.1 10 NAB 192.1 133.1 20 162.1 10 NNK 208.1 134.1 25 122.1 10 d4-NNN 182.1 123.1 20 152.1 10 d4-NNK 212.1 110.1 30 126.1 10 2.2固相萃取条件的选择 尝试了 SUPELCO LC-SI， SUPELCO ENVI-18， OASISMCX 等固相萃取小柱，发现OASIS MCX (30 mg) 固相萃取柱具有对分析物保留好，洗脱容易等优点，同时该柱润洗时间短，需要溶剂少，3-5min可以完成一个样品的富集和纯化。初步考察了烟丝萃取液 PH 值对 OASIS MCX(30mg)固相萃取的影响，发现PH值在4-12范围内都可以使分析物很好的保留在SPE 柱上，但是当PH值小于9时，分析物无法用甲醇洗脱下来，因此烟丝萃取液上固相萃取前先用 NAOH 溶液调节 PH值至10左右。从图1可以看出，固相萃取后， NNN、NAB的色谱图得到明显的改善，内标d4-NNK的基质干扰得到消除， NNK 的基线也有所降低。 2.3萃取溶液的选择 烟叶和烟气滤片中的 TSNAs 的提取传统上采用二氯甲烷。但是用二氯甲烷提取最大的缺点是选择性差，绝大 注：上图由两张选择性离子检测 (SRM)色谱图组合而成，图中有积分阴影和名字标有星号的为固相萃取处理后的色谱图，其余为未经固相萃取纯化的色谱图。图中未列出 d4-NNN和 NAT的色谱图，因固相萃取前后这两种物质区别很小，均有理想的色谱图。 图1固相萃取前后的烟样色谱图 多数有机成分都能被其萃取下来，因而样品的纯化变得相当复杂，一般都要经过多次液-液萃取，固相萃取和浓缩的过程。Karl A. Wagner2等人提出用100mM的醋酸铵水溶液可以选择性萃取主流烟气滤片上的 TSNAs， 从而简化样品处理步骤。本文通过用不同浓度的醋酸铵水溶液超声萃取烟丝，发现NNN 和NAT在醋酸铵浓度为0~0.02mol/L 之间萃取量较大，而NNK 和NAB 在整个浓度变化范围内萃取量基本没有变化(见图2)，因此采用纯水作为萃取剂。 注：萃取时间=30min 图2TSNAs 的萃取液浓度与萃取量关系曲线 2.4萃取时间的选择 试验了不同萃取时间对 TSNAs 萃取量的影响(见图3)，发现各 TSNA 的萃取量随时间的变化不大，特别是NNK 和NAB， 几乎没有什么变化，这可能与 TSNAs 的水溶性较好有关。在30min 后4种 TSNAs 的萃取量基本恒定，这与文献结论I13]基本一致，因此选取 30min 作为萃取时间。 图3 TSNAs 的萃取量与萃取时间关系曲线 2.5线性关系和检测限 将 TSNAs 的储备液分别制备成200.0，100.0，80.0，40.0，20.0，8.0，4.0，2.0，1.0ng/mL的系列标准溶液，按色谱条件测定，以峰面积Y对相应的质量浓度 X(ng/mL)进行线性回归，得到回归方程和相关系数；将逐级稀释的工作标准分别进样3pL，以色谱峰信噪比等于3计算检测限(见表3)。 定量离子 回归方程 R² 检测限(ng/ng)S/N=3 (m/z) NNN 148.1 Y=-0.0109+0.0249X 0.9999 0.7 NAT 160.1 Y=-0.0209+0.0243X 0.9993 0.5 NNK 122.1 Y=-0.0164+0.0383X 0.9998 0.5 NAB 162.1 Y=-0.02868+0.054X 0.9998 0.4 2.6方法重现生 按1.2要求处理和1.3条件分析7份相同的卷烟烟丝样品，得到方法重现性数据(见表4)，数据表明该法对4中TSNA的相对标准偏差均小于8%，重现性较好。 表4烟丝样品的方法重复性 n=7 NNN(ng/g) NAT(ng/g) NNK(ng/g) NAB(ng/g) #1 206.4 160.2 57.7 6.2 #2 211.2 165.5 54.1 7.0 #3 202.9 153.5 61.2 6.0 #4 238.2 159.1 47.6 6.4 #5 213.6 171.5 60.0 6.5 #6 225.6 156.1 56.6 6.6 #7 215.4 162.8 57.1 7.2 平均值 216.2 161.2 56.3 6.6 标准偏差 12.1 6.0 4.5 0.4 相对标准偏差% 5.6 3.7 8.0 6.4 2.7加标回收率 取3份已知 TSNAs 含量的相同烟丝样品做平均加标回收率。每份样品根据4种 TSNA 的实际含量添加不同量的TSNA，按1.2要求处理和1.3条件分析，计算加 化合物 原始量(ng) 加入量(ng) 平均测定量(ng) 平均回收率(%) NNN 211.6 200.0 409.5 99.0 NAT 189.3 200.0 380.6 95.7 NNK 52.2 50.0 101.8 99.2 NAB 8.7 10.0 18.3 96.0 标回收率(见表5)。结果表明，4种TSNA 回收率都大于96%，说明样品基质对 TSNAs 的测定干扰很小，测定结果真实可信。 2.8部分卷烟烟样测试结果 测试了部分国内烤烟和国外混合型烟样品(表6)， 其中国内烤烟型1，2为四类卷烟，国内烤烟型3，4， 5 为一类卷烟。从表6中可以看出，国内烤烟型卷烟的 TSNAs含量明显低于国外混合型卷烟。一类卷烟的 TSNAs的含量明显低于四类卷烟。 表6部分卷烟烟样测试数据 NNN(ng/g) NNK(ng/g) NAT(ng/g) NAB(ng/g) 国外混合型1 1193.1 206.8 500.8 31.3 国外混合型2 2031.2 984.3 1896.3 110.9 国内烤烟型1 211.6 52.2 189.3 8.7 国内烤烟型2 216.2 56.3 161.2 6.6 国内烤烟型3 41.9 41.3 90.7 3.5 国内烤烟型4 46.3 48.9 125.7 3.5 国内烤烟型5 33.3 38.0 75.5 4.5 ( 参考 文 献 ) ( [1 ] B lot W J， Fraumeni J F . 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