莽草酸中莽草酸与其对映体的分离检测方案(毛细管电泳仪)

PTCA(PARTB：CHEM.ANAL.)理化检验-化学分册2008年第44卷3 理化检验-化学分册邓光辉等：毛细管电泳分离莽草酸及其对映体 毛细管电泳分离莽草酸及其对映体 邓光辉1.2刘榕城”胡 炜，张桂华 (1.广西民族大学化学与生态工程学院，南宁530006； 2.广西大学化学化工学院，南宁530004) 摘 要：采用毛细管电泳分离莽草酸及其对映体。试验了缓冲溶液的种类、浓度、pH值、分离电压、进样时间、添加剂对分离的影响。结果表明：以30 mmol.L三(羟甲基)氨基甲烷-30 mmol ·L HB0s (p H 8.6)为缓冲体系，在波长214 nm，分离电压为15 kV，进样时间为10 s的条件下，实现了对莽草酸及其对映体的分离。 关键词：高效毛细管电泳；莽草酸；对映体；分离 中图分类号：0657.3 文献标识码：A 文章编号：1001-4020(2008)03-0275-03 Capillary Electrophoretic Separation of Enantiomorphs of Shikimic Acid DENG Guang-hui'2，LIU Rongcheng’， HU Wei， ZHANG Gur hua' (1. College of Chemistry and Ecological Engineering， Guangxi University for Nationalities， Nan ning 530006， China；2. College of Chem. and Chem. Engineering， Guangxi University， Nan ning 530004， China Abstract ： High performance capillary electrophoresis was applied to the separation of enantiomorphs ofshikimic acid. Several important factors influential to the separation i.e. p H and concentration of the running buffersolution， working voltage of separation， time of sample introduction and the use of additives， were studied andoptimized. Enantiomorphs of shikimic acid were separated satisfactorily under the follwing optimized conditions： ①running buffer solution： 30 mmol1·L Tris ·HCl+30 mmol ·L HsBO： (pH 8.6)；②working voltage ofseparation： 15 kV；③wavelength of UV-detection： 214 nm； ④time of sample introduction： 10 s. Key words ： Capillary electrophoresis； Shikimic acid； Enantiomorph； Separation 莽草酸是合成生物体内新陈代谢化合物的中间体，也是合成许多生物碱、芳香氨基酸与吲哚衍生物、手性药物(如抗病毒药)的原料。莽草酸能通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成，具有抗炎、镇痛作用，还可作为抗病毒和抗癌药物中间体1，2]，也是合成临床上对感染禽流感病毒的人有效的药物“达菲”的重要原料31，对禽流感病毒也有一定的抑制作用。毛细管电泳具有高效、快速、灵敏、样品用量少等特点，是近年发展起来的一种新型高效分离分析技术，已经广泛应用于药物的分离分析。 ( 收稿日期：2007-06-13 ) ( 基金项目：广西自然科学基金项目(桂科自：0236037，桂科自： 0640038)资助 ) ( 作者简介：邓光辉(1957-)，男，广西人，教授，主要从事天然产 物化学研究。 ) 试验部分 1.1 主要仪器与试剂 CL2001高效毛细管电泳仪紫外检测器；石英毛细管柱(75 um X55 cm) ；UV/VIS 916 型紫外-可见分光光度计。 缓冲溶液：分别配制100 mmol·L-的柠檬酸(Cit)、HsBO3、磷酸氢二钠、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris) ，25 mmol·L十二烷基硫酸钠(SDS)作为储备液。试验时，按比例各取适量配成所需的电泳运行缓冲溶液。 样品溶液：用配制好的缓冲溶液将莽草酸标准品溶解，并配制成10 mmol ·L的样品溶液。 试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 1.2 试验方法 连接好毛细管电泳仪及紫外检测器。毛细管柱在使用前依次用0.1 mol·L氢氧化钠溶液， 0.1mol·L盐酸溶液，二次蒸馏水和运行缓冲溶液分别冲洗约5 min。采用重力进样方式，进样高度差为20cm，进样时间为10s，分离电压为15kV，紫外检测波长214nm，运行缓冲溶液和样品溶液均经0.45um微孔滤膜过滤后使用。试验在恒温(25℃)恒湿(相对湿度65%)的试验条件下进行。 2 结果与讨论 2.1 检测波长的选择 采用紫外-可见分光光度计对莽草酸吸收峰进行检测，得到莽草酸的紫外吸收波长为214 nm。选用莽草酸的分离检测波长为214nm。 2.2 缓冲体系的选择 试验中比较了磷酸盐、TrisCit 和 Tris H上BO3三种不同浓度配比的缓冲溶液对分离的影响。其中磷酸盐体系由于离子强度大，不能采用高浓度的缓冲液，限制了缓冲容量；而 Tris 体系的离子质量大，电导低，采用高浓度、高电压不会产生大电流。因此可以通过提高缓冲溶液的浓度和分离电压来改善分离度和缩短分析时间。而且硼酸能够与羟基进行络合，生成络阴离子。试验结果表明：Tris-HBO3 体系能检测出莽草酸的吸收峰。选用 Tris-H3BO3缓冲溶液为最佳体系。 莽草酸分子结构中有三个羟基、一个羧基、一个双键，结构如图1(a)。对于含多羟基的化合物，硼酸是一种较理想的体系，因为硼酸能够与邻位的二羟基络合，生成络阴离子[4]，既是缓冲剂，又是拆分剂。 (a) (b) 图1 苯草酸分子结构 Fig.1 Molecular structure of shikimic acid 对比了30 mmol·L- HH：BO3-30 mmol·LTris(pH 8.6)和30 mmol·L Tris(用 Cit 调 p H为8.6)对分离的影响，结果如图2。 由图2可见在同样的pH下不含硼酸的缓冲体系不能将莽草酸及其对映体分离。这是由于莽草酸的邻二羟基在同一平面上，容易与硼酸生成络合物如图1(b)(R为左旋体，S为右旋体)，改变了其荷质比。 2.3 pH值的影响 pH值是影响分离度的一个重要因素。莽草酸.2766. 图2 不同缓冲体系对分离效率的影响 Fig.2 Effect of different buffer systems on theefficiency of separation 与硼酸络合可生成结合一个氢离子的络阴离子4pH值对莽草酸的络合有着较大的影响。 在30 mmol·L硼酸中分别加入不同浓度的Tris ，测定不同pH值缓冲体系对分离的影响，见图3。 5 pH=8.6 pH=9.0 图3 pH 值对分离的影响 Fig. 3 Effect ofp H value on separation 由图3可见，30 mmol ·L-硼酸中加入30mmol·L-Tris (SDS浓度为5 mmol ·L)，当pH为8.6时，缓冲体系能获得较好的分离。 2.4 缓冲溶液浓度的选择 在毛细管电泳中，缓冲溶液的浓度是一个很重要的指标。离子浓度增加，改变溶质和管壁之间物质的相互作用，改善分离。缓冲溶液的浓度过大将 产生大量的焦耳热，导致峰形变差。因此，需要选择合适浓度的缓冲溶液以获得较高的灵敏度和良好的分离度。考查了10，20，30，40，50 mmol·L的缓冲体系，试验结果表明：当缓冲液浓度为30 mmol·L时，分离效果最佳。 2.5 十二烷基硫酸钠的选择 SDS是一种阴离子表面活性剂，具有吸附、增溶等功能。SDS浓度太低时，样品吸附导致峰形拖尾；SDS浓度较高时，噪音较大，峰形较差。试验结果表明：当SDS的浓度为5 mmol·L时，能够获得较好的分离结果。 2.6 运行电压的选择 在高效毛细管电泳中，分离电压不仅影响被测化合物的迁移时间，而且对分离度、峰高都有不同的影响。高的分离电压可以改善分离度，缩短分析时间。但是电压过高，毛细管内产生的焦耳热不容易散发，将引起柱效和分离度的降低，电压过低则分离时间过长。试验结果表明：运行电压越大，分析所用时间越短，但超过15kV时，焦耳热过大，基线不稳；电压过小，分离时间太长，且分离度小。试验选择运行电压为15kV。 2.7 进样时间的选择 进样时间决定了进样量。进样量太小，达不到检测器的灵敏度；进样量太大，样品塞长度超过扩散引起的区带增宽，使分离效率和分离度变差。当进样时间为10s能够获得较好的峰形。 本研究工作建立了毛细管电泳分离莽草酸及其对映体的方法，探讨了其拆分机理。结果显示：以30 mmol·LTris + 30 mmol1·LH3BO3+5 mmol ·LSDS(pH 8.6)为电泳介质，在15kV电压下两种异构体得到较好的分离。 ( 参考文献： ) ( [1]3 马怡，孙建宁，徐秋萍，等.莽草酸对血小板聚集和凝 血的抑制作用[J].药学学报，2000，35(1)：1-3. ) ( [2] Hidalgo M E ， F ernandez E ， Ponce M， e t al. Photo- physical， photochemical， an d thermodynamic properties of shikimic a cid d erivatives： calycin and rhizocarpicacid (lichens) [J] . Journal of Photochemistry and Pho-tobiology B Biology， 2002，66：213-217. ) ( [3] 向莉，李盾.达菲的主要合成中间体莽草酸获得的新 进展[].医药产业资讯，2006，3(6)：51-52. ) ( 41 郑一宁，谢天尧，莫金垣，等.双黄连粉针剂中黄芩苷的 高效毛细管电泳-电导检测[J].分析测试学报，2001， 20(6)：21-24. ) 2008中国(广州)国际分析测试仪器/生物技术展览会暨技术研讨会 2008中国(广州)国际分析测试仪器/生物技术展览会暨技术研讨会于2008年5月13~15日在广州、中国进出口商品交易会(流花路)展览馆举行。同时举办的高层行业学术/技术交流会有： (1)华南、华中、西南地区仪器协作网会员联谊会(中国广州分析测试中心承办)； (2)“现代实验室技术---来自英国李尔集团的见解”(英国李尔集团和广东省科学技术实验室联合会联合承办) ； ( (3 ) “2008广东省高等教育学会实验室管理专业委员会会员大会”； ) (4)“2008中国(广州)国际分析测试技术研讨会”(广东省分析测试协会等单位承办)； (5)“2008第三届广州国际生物医药论坛"(华 南基因组研究中心、南方医科大学生物工程研究所联合承办)； (6)“2008华南制药原辅料与中间体展览会暨技术研讨会”(中国医药质量管理协会、北京大学药物信息与工程研究中心等单位联合承办)； (7)汇聪采购商大会。 有意参会和参展者请与广东国际科技贸易展览公司(广东科展)王国斌，叶尘，刘伟斌，李慧联系。地址：广东市连新路171号广东省科技厅大院( 510033)；电话：020-83604287，83549125，83558312，83558271；传真：020-83549078，83517123，Emall；bio @ste.cn；网址：http：//www.biosouthchina. com；http：//www. ste. cn。 ·China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net