毛细管区带电泳分离甲酚异构体的研究

62010 ，19(2)福建分析测试Fujian Analysis & Testing 72010，19(2)唐爱东等：毛细管区带电泳分离甲酚异构体的研究 毛细管区带电泳分离甲酚异构体的研究 唐爱东苏琳娜钟岩亮孙小龙 (中南大学化学化工学院，湖南长沙410083) 摘 要：本文系统地研究了邻、间、对甲酚三种异构体在毛细管区带电泳中的迁移行为。通过实验研究讨论了缓冲溶液类型、缓冲溶液的pH值、缓冲溶液的浓度和添加剂等因素对三种异构体分离的影响获得了优化的分离条件。结果表明，在使用未涂层石英毛细管柱(50p mx 50cm ，有效长度为45 cm) ，检测波长225 nm ，磷酸盐-环糊精-硼砂缓冲溶液浓度30mmol/L 缓冲液pH值为11.60，分离电压为15kV的条件下，甲酚三种异构体得到基线分离。 关键词：毛细管区带电泳；甲酚异构体 中图分类号：0657. 文献标识码：A文章编号：1009-8143(2010)02-0006-05 Study on Separation of Cresol Isomers by Capillary Zone Electrophoresis Tang Ai-dong， Su Lin-na， Zhong Yan-liang， Sun Xiao-long (School of Chemistry and Chemical Engineering， Central South University， Changsha， Hunan 410083，China)Abstract ： The migration behavior and separation of three cresol isomers were investigated by capillary zone electrophoresis.Effect of the composition of running buffer， the pH value and the additives on the separation of cresol isomer was investigated toacquire the optimum conditions. The results indicated that o-， m-， p- cresol isomers are optimally separated under UVdetection at 225 nm wavelength， 30 mmol/L phosphate- cyclodextrin- borate of pH 11.60 as buffer and in a 50 cm length of 50u m diameter uncoated- silica capillary at separation voltage of 15 kV. Keywords ： Capillary zone electrophoresis； cresol； isomers 甲酚是重要的精细化工中间体，包括三种异构体，即邻甲酚、间甲酚和对甲酚，广泛应用于农药、医药、香料、燃料、抗氧剂、阻聚剂、紫外线吸收剂、燃料添加剂、橡胶助剂、饲料添加剂和合成材料领域，研究其分析方法对于生产监控和产品质量检测具有重要意义。邻、间、对甲酚异构体的主要特点是结构相似、物化性质相近 pKa 值分别为 10.29、10.09、10.26，差别不大，采用常规的4-氨基安替比林法"和溴化滴定法只能测定总酚的含量，难以分离检测甲酚异构体，这给水体中甲酚异构体的分析检测带来了不便。空气中甲酚的测定方法有示波极谱法，气相色谱法[4.5]，气相色谱法可以分离并同时检测甲酚位置异构体，秦金平等应用自制环糊精衍生物毛细管实现了甲酚、二甲酚位置异构 体的分离。但是未见采用毛细管电泳法分离分析甲酚异构体的报道。采用毛细管电泳检测其它酚类污染物有相应的文献报道17-9]主要是研究在低浓度范围提高酚类污染物的检测灵敏度，在缓冲溶液中加入添加剂以提高分离效率110，11。在非水介质中，应用毛细管电泳法可实现快速分离与分析酚类化合物，并可通过调节有机溶剂的类型和浓度提高分离的选择性2. 毛细管电泳方法作为一种强有力的分离分析技术，因具备灵敏度高、选择性好、仪器简单、样品及溶剂消耗量小等优点而越来越受到重视，用于检测酚类污染物有着十分强大的优势适合于环境与生物样品中酚类污染物的检测。本文研究了采用毛细管电泳法分离甲酚三种异构体，探讨了电泳缓冲 ( 收稿日期20 0 9-11-17 ) ( 作者简介唐爱东(1968-)女博士副教授，主要从事功能材料制备与分析仪器研究。E- mail：ta n gaidong@126.com ) 液的组成、缓冲液的浓度及 pH 值和添加剂等因素对邻、间、对甲酚迁移行为的影响，可为水体中甲酚三种异构体的分析检测提供实验数据。 1 实验部分 1.1 主要仪器与试剂 CL1030型毛细管电泳仪(北京彩陆仪器有限公司)，未涂层石英毛细管(河北永年锐沣色谱器件有限公司)，2001型超纯水发生器(德国 SG公司)超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ，PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。 硼砂(分析纯，上海试一)，邻甲酚、间甲酚、对甲酚(均为分析纯，国药集集)，甲醇(色谱纯)，磷酸三钠、磷酸二氢钠(均为分析纯)，环糊精，氢氧化钠，碳酸钠等。 1.22溶液的配制 标准溶液的配制：精确称取分析纯邻甲酚、间甲酚和对甲酚各27mg，分别用色谱纯甲醇溶解并用二次重蒸水稀释至100mL， 得到甲酚含量均为0.27mg/mL的标准储备液，并避光保存。取50mL容量瓶5只，分别加入1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL的 0.27 mg/mL 邻甲酚标准储备液，然后分别用二次重蒸水稀释至刻度，配制成邻甲酚含量分别为5.40×103，1.08×102，1.62×102.16×1022.7×10mg/mL 的标准系列溶液。用相同的方法分别配制间甲酚和对甲酚标准系列溶液。 邻、间、对甲酚混合溶液的配制取不同体积的邻、间、对甲酚标准储备液置于 50mL容量瓶中，用二次重蒸水定容至刻度配制成邻、间、对甲酚含量分别为1.08×10mg/mL 2.70× 10 mg/mL ，1.08×10?mg/mL 的混合溶液，进行毛细管电泳检测。 磷酸盐、硼砂缓冲溶液分别用磷酸二氢盐、硼酸或氢氧化钠、碳酸钠调节至合适的pH 值。 1.3 电泳条件 毛细管：内径50p mx 50cm ，有效长度 45cm ，未涂层；毛细管在每次进样前分别用 0.1mol/LNaOH、二次重蒸水冲洗和缓冲溶液冲洗 2min ；更换缓冲体系时，依次用 0.1mol/L NaOH、二次重蒸水及新配缓冲溶液分别冲洗毛细管 3min ，同一缓冲溶液运行10次后更换实验所需溶液均经超声脱气。毛 细管电泳检测的控制电压为 15kV 紫外检测器的检测波长为 225nm ，控制进样高度为20cm，进样时间为 10s. 2 结果与讨论 2.1 缓冲体系的选择 缓冲体系由缓冲试剂和 pH调节剂两部分构成，其中缓冲试剂的选择主要由所需要的 pH值决定，而该值由样品的性质和分离效率不同而不同，pH的选择是决定分离成败的一大关键。与缓冲试剂一样pH调节剂也会显著影响毛细管电泳的分离能力。由于多数缓冲试剂属酸性物质，所以pH调节剂主要为碱，常用的有KOH、NaOH等。若缓冲试剂为碱则对应的 pH 调节剂即为酸尽量用弱酸。图1为分别用硼砂和磷酸盐作为缓冲体系分离甲酚异构体的电泳图缓冲体系的pH均为10.5。从图1可以看出，甲酚在 pH为10.5硼砂缓冲体系中完全不能分离，在磷酸盐缓冲体系中 ，pH值相同的条件下分离度增大。因此，选择磷酸盐作为缓冲溶液有利于甲酚异构体的分离。 图1缓冲体系对甲酚异构体分离的影响(a-硼砂缓冲体系，b-磷酸盐缓冲体系) 注：缓冲液浓度 25mmol/L， pH=10.50，邻、间、对甲酚含量分别为 1.08×102，2.70×103，1.08×10mg/mL 2.2缓冲溶液pH值对分离的影响 以磷酸盐为缓冲溶液，研究缓冲溶液 pH值对甲酚异构体的分离的影响。图2为磷酸盐缓冲溶液pH 值对甲酚异构体分离影响的电泳图。从图2可以看出，甲酚在 pH10.5的磷酸盐缓冲体系中并没 有完全分离。在 pH 大于11时三种异构体之间逐渐可以分离其出峰顺序为对、邻、间，旦是峰与峰之间仍有部分重叠，未能完全分开。 图2磷酸盐缓冲体系中pH值对甲酚分离的影响(a-pH 10.50，b-pH11.60) 注：缓冲液浓度 25mmol/L，邻、间、对甲酚含量分别为1.08×10-2，2.70×103，1.08×10 mg/mL 酚是一类很弱的酸其羟基上氢能发生离解游离出氢离子，因此呈弱酸性。酚的酸生强弱可用离解常数 Ka 或离解常数对数的负值pKa=-1gKa 来表示。酸性越强 ，Ka 越大 ，pKa 越小吲。在酸性或中性环境下酚的离解受到抑制，即带负电的RO很少甚至可忽略，在毛细管电泳中只受电渗的推动，不能得到分离。而在碱性环境下酚的离解大大增强，带负电荷的RO增多在毛细管电泳中受到移向高压负极的电渗力和移向正极的电泳力二者的共同作用。由于电渗力远远大于电泳力最终仍将达到高压负极。pKa 越小，即离解度越大的酚，带负电荷的RO也就越多分子大小相同的情况下电泳速度也就越快。但由于电泳方向是正极，因此在电渗力的作用下，最迟达到负极，即最迟出峰，而酸性弱的酚则最早出峰。可见缓冲溶液的 pH值对分离有着十分重要的影响。 2.3 添加剂对分离的影响 通过改变缓冲溶液的 pH值未能使甲酚异构体分离完全，因此我们选择加入添加剂来提高甲酚异构体分离度。环糊精及其衍生物是毛细管电泳中最常用的手性选择剂。环糊精(cyclodextrin ，简称CD)是由6~8个吡喃葡萄糖单元以1，4-苷键相连组成的环状化合物具有中空圆筒状构造，筒内成疏水系，筒外成亲水系，因此具有较好的立体选择性。由于环糊精特殊的空腔结构，对间、对位异构体有特殊的选择性，能够很好地分离混酚体系。 图3为添加不同量的环糊精对甲酚异构体分离的影响。从图3可以看出磷酸盐缓冲溶液 pH11.60时未加入环糊精，对甲酚和邻甲酚完全重叠，而加入环糊精的缓冲液加大了对甲酚和邻甲酚之间的分离度。但是由于邻甲酚出峰时间的延迟，邻甲酚与间甲酚发生了重合。随着环糊精比例的加大，邻甲酚将最后出峰，但是环糊精浓度过高会在毛细管中形成胶束，分离度也会随着降低，因此环糊精的加入量存在最优条件。实验结果表明选择β-环糊精作为添加剂可以提高甲酚异构体的分离度，在环糊精比磷酸盐缓冲溶液(w/v)约为0.4的时候，这三种异构体之间有最大的分离度，但是邻甲酚和间甲酚并未分离完全。 图3环糊精对甲酚异构体分离的影响(a-磷酸盐，b-磷酸盐-环糊精) 注：缓冲液浓度 25mmol/L，pH=11.60，邻、间、对甲酚含量分别为 1.08×10，2.70×10~，1.08×10mg/mL 2.4 硼砂对分离的影响 从图3看出在 pH11.60的磷酸盐缓冲溶液中，通过添加环糊精并没有完全实现甲酚的基线分离，图4的结果表明在磷酸盐缓冲体系中同时添加硼砂可以提高间甲酚与对、邻甲酚之间的分离度，从而最终实现三种甲酚异构体的完全分离，出峰顺序为对、邻、间。 图4缓冲溶液中加入硼砂对甲酚异构体分离的影响 (a-磷酸盐-环糊精，b-磷酸盐-环糊精-硼砂) ( 注：缓冲液浓度 25mmol/L ， pH=11.60，邻 、 间、对甲酚含量分别 为1 . 08×1 0 2，2.70×10~3，1.08×10 m g/mL ) 2.5缓冲溶液浓度对分离的影响 缓冲溶液浓度会影响分离度和分析时间，因此选择合适浓度的缓冲液对毛细管电泳紫外检测非常重要。缓冲液的浓度一般控制在10~200 mmol/L之间。电导率高的缓冲液如磷酸盐和硼砂等其浓度一般控制在 20 mmol/L左右，而电导率小的缓冲液如硼酸等其浓度可大于100 mmol/L。 图5反映了缓冲溶液中磷酸盐的浓度对甲酚异构体分离的影响。从图5可以看出，磷酸盐浓度为20~40mmol/L时，甲酚的三种异构体均可以得到分离。磷酸盐浓度为 20~30mmol/L时，随着浓度的增大，迁移时间逐渐缩短；磷酸盐浓度为30~40mmol/L时，随着浓度的增大，迁移时间逐渐延长，同时，浓度太高，会造成焦耳热过大，基线不稳定故缓冲溶液中磷酸盐的最佳浓度为 30mmol/L。 2.6线性关系和检出限 以30 mmol/L磷酸盐-环糊精-硼砂为缓冲溶液pH=11.60，电压为 15kV 检测波长为225 nm的毛细管电泳分离条件下分别测定邻、间、对甲酚 标准系列溶液，作标准曲线所得各异构体的标准曲线方程及相关系数见表1。由表1可知在最佳检测条件下，方法的线性关系良好，对、令、间甲酚的线性相关系数为 0.9990~0.9997。在最佳检测条件下，按信噪比3：1时计算最低检出限，甲酚异构体的检测限见表1。 图5缓冲溶液浓度对甲酚分离的影响 注：磷酸盐-环糊精-硼砂缓冲体系， pH=11.60，邻、间、对甲酚含量分别为 1.08×102，2.70×103，1.08×10mg/mL 表1对、邻、间甲酚的线性关系和检出限 化合物 线性方程 相关系数 检出限(mg/mL) 对甲酚 y=23309x-2127 0.9997 1.04×10 邻甲酚 y=18325.9x-1928 0.9993 1.21×103 间甲酚 v=17134.1x-1005 0.9990 7.11×104 3：结论 研究结果表明，缓冲体系对甲酚异构体的分离与分析有很大的影响。选择合适的缓冲溶液及控制缓冲溶液 pH 值使甲酚异构体的分离度有很大的提高在缓冲溶液中加入添加剂对分离产生了很好的效果。试验发现以30 mmol/L 磷酸盐-环糊精-硼砂为缓冲溶液 pH=11.60 ，电压为 15 kV ，检测波长为 225 nm 的毛细管电泳分离条件下可有效地分离邻、间、对甲酚三种异构体。 ( 参考文献 ) ( [1]杨功勇.4-氨基安替比林法测定挥发酚常见问题的探讨 [滁州学院学报，2004，6(4)：118-119. ) ( [2]务宗伟，陈合刚.应用光度法和溴化滴定法测定废水中挥 ) ( 发性酚的比较[.黑龙江环境通报，2000， 24(3)：39，68-69. ) ( [3]孙成均，王崧，刘纪艳.示波极普法测定空气中甲酚[].中华 预防医学杂志，1999，33(6)：375-376. ) ( [4]赵沁.气相色谱法测定甲基苯酚异构体[.山东化工，1998， (5)：14- 1 5. ) ( [5]张月琴，史雪岩，傅若农，等.毛细管气相色谱法分析苯酚和 甲酚位置异构体.北京理工大学学报，2000，20(3)： 380-384. ) ( [6]秦金平，马珂.自制环糊精衍生物毛细管柱对甲酚二甲酚位置异构体的分离[].研究化学世界，2006：530. ) ( [7]Wang J， Chatrathi M P， Tian B. Capillary electrophoresis mi-crochips w ith t h ick- film a m perometric de t ectors： se p arationand detection of phenolic compounds1 S J []. Analytica ChemicaActa，2000，416：9-14. ) ( [8]Rodrfguez I ， Turnes M I， Bollafn M H， Mejuto M C， Ce l a R. Determination of phenolic pollutants in drinking water by cap-illary electrophoresis in the sample stacking mode[]. J o urnal ofChromatography A， 1 997， 778 (1-2)：279-288. ) ( (下转第13页) ) 表2与标准方法对照实验 样品标号 标准量(mg/mL) 本方法 药典方法 测量值(mg/mL) 相对标准偏差(%) 测量值(mg/mL) 相对标准偏差(%) 1 5.00 5.08±0.21 3.5 5.06±0.003 0.06 2 5.00 4.99±0.07 1.2 5.004±0.003 0.05 3 5.00 4.89±0.43 3.8 4.83±0.012 0.20 ( 参考文献 ) ( [1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(二部) [M.北京：化工出版社，2005：438-439. ) ( [2]李梦龙，邱细敏，俞汝勤，等.双波长标准加入法用于复方药物光度分析[.分析试验室，1991，10(2)：20-27. ) ( []Lemus Gallego J M， Pe r ez Arryo J. Spectrophotometric det e r- mination of h ydrocortisone， n y statin a n d oxytetracycline in sy n -thetic and pharmaceutical p reparations based o n various uni-variate and multivariate methods[] . Ana1.chima.Acta，2002，46：85-97. ) ( [4]马红燕.荧光光度法测定氢化可的松的研究[.光谱实验 室，1999，16(5)：548- 5 50. ) ( [5]胡道德，辛维旋.旋光法测定复氢霜中氢化可的松的含量 [].华西药学杂志，1998，13(3)：196-197. ) ( [6]张赛男.旋光法测定氢化可的松二甲基亚砜溶液中氢化可 ) (上接第9页) ( [9]唐爱东，孙小龙，李传常，等.苯二酚异构体电迁移行为预测 与研究[.分析试验室，2008，27(6)：85-88. ) ( [10]LiG， Lo c ke D C. Nonionic surfactants for improving resolution of the priority pollutant phenols by micelle- m o dified ca p illary electrophoresis 1 S []. Journal of Chromatography A， 1996， 734(2)：357-365. ) ( [1 1 ]Erim F B. Effect o f cationic polymer on the separation of p he- nols by capillary Electrophoresis []. Journal of Chromatogra- phy A， 1997， 768(1) ： 161-167. ) ( [12]Morales S， Cela R . C a pillary e l ectrophoresis a nd sample ) 的松[].海峡药学，1997，9(3)：53-54. ( [7]单萍萍，申国庆.高效液相色谱法测定复方联苯苄唑搽剂中联苯苄唑和氢化可可松的含量[].江苏药学与临床研究， 2006，14(I)：26-28. ) ( [8]杜静，傅应华.离子对反相高效液相色谱法同时测定复方氟脲嘧啶二甲亚砜溶液中氟脲嘧啶和氢化可的松的含量[].中国现代应用药学杂志，2005，22(2)：163-165. ) ( [9]Min J，Wen R J. Chinese Chemical Lett e rs ，20 0 2 ，13 (9 ) ：867—87. ) ( [10]吴迎春，刘谦光，王亦群，等. HPLC-高效液相色谱化学发光法测定注射液中氢化可的松的含量 [].分析析试室， 2000，19(6)：30-32. ) ( [11]范顺利，李巍，林金明，等.反相流动注射-化学发光法测定氢化可的松[].分析化学，2004，32(11)：1421-1425. ) ( [12]熊迅宇，唐玉海，王楠楠，等.流动注射-化学发光法测定氢化可的松[.西安交通大学学报(医学版)，2007，28(3)： 340-342. ) ( stacking in non-aqueous media for th e an a lysis of prioritypollutant phenols[]. Journal of Chromatography A， 1 9 99， 846：401 - 411. ) ( [13]杨晓云，王立世，莫金垣，等.毛细管电泳安培法检测酚类化合物[.分析试验室，2001，20(3)：5. ) ( [ 1 4]H. T. L uong J， A. L . N g uyen. Ac h iral selectivity in c y clodex- trin- modified capillary electrophoresis []. Journal of Chro-matography A， 1 997， 792(1-2)：431-444. ) ( [15]康杰分，李清岭，寿崇琦.环糊精及其衍生物在毛细管电泳手性拆分中的应用[].化学分析计量，2006，15(6)：106-108. ) ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net