中药材中合成色素检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 HPLC 方法开发系统在有机合成色素分析方法开发上的应用 摘要：本文中使使岛津 HPLC 方法开发系统，建立了29种有机合成色素高效液相色谱快速分析方法，并采用方法转化软件转化为常规液相方法，实验验证分离效果良好。实验中在Shim-pack XR-ODS II 2 mm i.d.x150 mm L. 2.2 um 色谱柱上进行4种流动相和7种梯度条件的自动化方法探索，根据所得色谱图结果使用自动评测软件对各峰进行综合评价，以峰检出数和分离度综合评价最优者为该样品分析方法。 关键词：超高效液相色谱方法开发系统有机合成色素方法转化 色素一般包括天然色素和人工合成色素。人工合成色素价格低廉、颜色丰富、性质稳定、易量产的特点，应用范围和使用率远超天然食用色素。。人工合成色素大都由来源于煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料制成，医学研究表明，该类物质除具有一般毒性、致泻性和生殖毒性外，还可以可导致严重的致畸、致突变和致癌等严重危害。为此包括我国在内的世界各国均在食用色素的管理、合成色素的使用方面均有严格的规定，如我国的 GB2760-2007，欧盟的 94/36/EC 指令，美国联邦规定法21CFR70 中都对多种合成色素要求禁止或严格限量使用。 目前中药染色掺假现象时有发生，一些不法分子通过将一种物质染色冒充中药材，或将质量较差的中药材通过染色改善外观，以次充好，提高售价，来获取更大的经济利益。为了应对中药材或中药饮片中色素滥用用做法，开发能够同时检测多种色素的 HPLC 方法迫在眉睫。然而，常规的 HPLC 方法开发阶段耗时长，效率低，如果遇到同时检测的化合物数量较多则更为突出，所以该阶段往往成为整个 HPLC 分析过程的制约因素。 本实验使用方法开发系统建立了29种有机合成色素 HPLC 快速分析方法，并通过方法转换软件转化为常规液相方法，为有机合成色素的检测提供参考。 1实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 系统。具体配置为 LC-30AD×2(输液泵，配四元低压梯度比例阀)， DGU-20A5Rx2(在线脱气机)， SIL-30ACMP(自动进样器)， CTO-20AC(柱温箱，含 FCV-34AH(高压流路切换阀))， SPD-M20A(二极管阵列检测器)， CBM-20A(系统控制器)， Method Scouting Solution Ver. 1.00(方法开发系统工作站，) LabSolutions Ver.5.54SP1(色谱工作站)。 1.2分析条件 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 色谱柱： Shimpack XR-ODS II 2 mmB2 相一甲醇-乙腈(1/1，VV/V)IDx150 mm L.， 2.2 pm流速0.45 mL/min流动相： A1 相一0.1%甲酸水溶液柱 温40℃A2 相-20 mM 醋酸铵水溶液检测波长：Max Plot： 400-650 nm B1相一乙腈 2 结果与讨论 2.1通用梯度时间程序分析 以 5%B(0-1.5min)-90%B(17.5-22.5min)-5%B(22.51-25min)通用梯度时间程序对色谱柱和流动相体系进行测试。 表1.通用分析条件分析结果及评价 # 流动相组成 综合得分* 1 A1-B1 105 2 A1-B2 55 3 A2-B1 1819 4 A2-B2 1760 *综合得分：以峰检出数乘以各峰分离度之和记，分离度值大于3者均已3记。 根据评价结果，确定流动相A2-B1类型为该样品分析用流动相体系，即为A 相-20mM醋酸铵水溶液，B相-乙腈。 2.2梯度条件筛选及结果 在上步确定的流动相体系下进行梯度条件的筛选。筛选方案和结果如表2所示。 # 梯度初始%B 梯度终止%B 评价系统得分 1 90 1819 2 85 1808 3 80 1785 4 75 1847 5 5 70 1765 6 65 2046 7 60 2085 8 55 1952 9 50 1947 以第7种梯度变化方式 5-60%B综合评价得分最高，确定该样品的最佳分析条件为：色谱柱： Shim-pack XR-ODS II 2 mm i.d.×150 mm L.， 2.2 um 流动相：A-20mM 醋酸铵水溶液 B-乙腈 流 速：0.45mL/min 梯度程序：5%B(0-1.5min)-60%B(17.5min)-90%B(17.51-22.5min)-5%B(22.51-25min) 柱 温：40℃ 图1.29种色素UHPLC分离结果(400-650nm 最大绘图方式) 图2.29种色素在三波长下UHPLC分离结果(450、500、610nm) 2.3经过方法转化软件后的分析结果 对经过筛选后确定的分析条件进行方法转换软件 Shimadzu Method Transfer V1.00转换，按下列转换后分析条件所得结果如图2所示。 分析仪器： LC-20A 色谱柱：GL Science Inertsil ODS-42.1 mmID.x200 mmL.， 5 um流动相：A-20mM醋酸铵水溶液 B-乙腈 流 速：0.2mL/min 梯度程序：5%B(0-4.4min)-55%B(52.4min)-90%B(52.41-67.4min)-5%B(67.42min) 柱 温：40℃ 图2.29种色素 HPLC 分离结果(400-650nm 最大绘图方式) 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 3结论 使用岛津 HPLC 方法开发系统对29种合成色素的液相分析方法进行开发，经过通用条件分析和梯度条件筛选分析，对所得数据使用 Class-agent report 软件处理，根据峰检出数和分离度综合得分，获得评价最高的分析条件建立该样品的分析方法。该方法可在30 min 内完成29种合成色素的分析，为多组分样品分离条件的探索提供可行的方式。 附表本实验中所涉及的29种色素类化合物 No. 中文名 英文名 CAS No. 保留时间(min) 柠檬黄 Tartrazine 1934-21-0 1.422 2 新红 New red 220658-76-4 2.275 3 苋菜红 Amaranth 915-67-3 3.468 4 靛蓝 Indigo blue 482-89-3 4.419 5 胭脂红 Acid Red 18 2611-82-7 5.993 6 萘酚黄S Naphthol Yellow S 846-70-8 6.229 7 日落黄 Food Yellow 3 2783-94-0 6.502 8 亮黑 Brillant Black BN 2519-30-4 6.529 9 酸性红35 Acid red 35 6441-93-6 6.863 10 诱惑红 Allura acid AC 25956-17-6 7.507 11 红色 2G Acid scarlet G 3734-67-6 7.952 12 偶氮玉红 Food Red 3 3567-69-9 9.096 13 丽春红2R Ponceau 2R 3761-53-3 9.323 14 丽春红SX PONCEAUSX 4548-53-2 9.475 15 羊毛绿 Acid green BS 3087-16-9 9.725 16 坚牢绿 Food green FCF 2353-45-9 9.829 17 酸性橙1 ORANGE I 523-44-4 9.996 18 亮蓝 Brilliant Blue 3844-45-9 10.214 19 赤藓红 Erythrosine 16423-68-0 11.245 20 酸性蓝1 Acid blue 1 129-17-9 11.907 21 酸性橙2 Orange 2 sodium salt 633-96-5 12.240 22 荧光桃兆 B Phloxine B 18472-87-2 12.737 23 专利蓝 Acid blue 2 calcium salt 3536-49-0 12.770 24 弱酸性红3B weak acidred 3B 6826-53-5 13.624 25 孟加拉玫瑰红 Rose Bengal 632-69-9 13.719 26 酸性红3B acid pink 3B 6459-69-4 14.241 27 酸性橙3 acid orange 3 6373-74-6 15.355 28 溶剂黄2 Solvent Yellow 2 66-11-7 19.623 29 亮绿 Brilliant green 633-03-4 19.802 色 谱 柱：Shim-pack XR-ODS III 2 mm×150 mm, 2.2 μm流 动 相：A-20 mM 醋酸铵水溶液 B-乙腈流 速：0.45 mL/min梯度程序：5%B(0-1.5min)-60%B(17.5min)-90%B(17.51-22.5min)-5%B(22.51-25min)柱 温：40℃