猪肉中瘦肉精含量检测方案(液相色谱柱)

北京豫维科技有限公司联系系&肉品安全与检测小2015年第8期总第412期 水先生电话：18911849923心肉品安全与检测小北京豫维科技有限公司联系人：7卖业2015年第8期MEAT INDUSTRY总第412期 HPLC 法测定猪肉中瘦肉精含量 魏春红 赵吉娜” 张丽媛 崔娜娜 1.黑龙江八一农垦大学食品学院黑龙江大庆1633192.大庆化工研究中心黑龙江大庆163319 摘 要 主要运用高效液相色谱法来实现畜肉中克伦特罗的快速测定。肉类样品经固相萃取小柱和液相萃取法等前处理后，采用C色谱柱(250mm×4.6mm，5pm)，甲醇+水(45+55)为流动相，流速1mL/min，紫外检测波长为 244nm 测定，通过精密度试验和回收率试验证明该方法具有较好的精确性和准确性。 关键词 高效液相色谱固相萃取法 克伦特罗 肉类 Determination of clenbuterol content in pork by HPLC Abstract HPLC was applied to achieve rapid determination of clenbuterol in meat. The meat sam-ple was treated by solid phase extraction and liquid phase extraction and other pretreatment. The C18chromatographic column (250 mm×4.6 mm，5 um) was used. Water - methanol (45+55) was takenas mobile phase， and the flow rate was 1mL/min. The wavelength of UV detection was 244 nm. Throughprecision experiment and recovery experiment， it was proved that this method was of better precision andaccuracy. Key words HPLC； clenbuterol； meat 克伦特罗(clenbutero1) 属于儿茶酚胺衍生合成的一类化合物，化学名称为4-胺基-a-(叔丁胺甲基)-3，5-二氯苯甲醇，分子式为 CHi8 C2NO，，熔点174~175.5℃，无色微结晶粉末，易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于氯仿，不溶于苯。克伦特罗作为一种常用的饲料添加剂，存在使用剂量严重超标，使用周期较长且热稳定性和生化稳定性极强等特点。导致在动物体内残留超标，人食用超标残留的动物组织后，会产生一些较严重的副作用进而影响身心健康[2~4]。从食品安全角度考虑，对食用动物组织中的克伦特罗残留量进行必要的检测具有十分重要的意义。 近年来，不少国家制定了饲料及动物体内盐酸克伦特罗添加量及残留量的检测方法5。现在国内外目前应用最广泛的有酶联免疫(ELISA)法、气相色谱-质谱(GC-MS)法和高效液相色谱(HPLC) ( 作者简介：魏春红(1982-)，女，实验师，黑龙江八一农垦大学硕士，现主要从事农产品精深加工方向。 ) 法6，7。我国在这方面的检测工作起步较晚，伴随着国际和国内对克伦特罗的禁用和监控要求，提出了从酶联免疫法(ELISA)筛选、高效液相色谱法(HPLC)定量到气质联机法(GC-MS)确证和定量的国标法来满足我国动物性食品中克伦特罗残留监控的需要。此方法存在操作繁琐，耗时较长、大量消耗有机溶剂，费水费电等缺点。同时此法根本不能作为肉类工业连续化、大批量生产过程中的质量控制手段，而只能用于事后检测。 本文主要研究用固相萃取法和液相色谱法快速制备冷冻猪肉、冷冻鸡肉、冷冻牛肉的样液，用高效液相色谱法测定样液中盐酸克伦特罗的含量，并进行精密度实验和回收率试验，评价该方法的精确性和准确性。 研究方案 1.1 实验材料 肉，九区批发市场市售鸡鸟；牛肉。 1.2 主要试剂 甲醇，乙醇，异丙醇，乙酸乙酯(均为分析纯)；高氯酸 0.1mol/L；氢氧化钠 1mol/L；氯化钠；磷酸磷酸二氢钠(pH=6.0)0.1mol/L。 1.3 主要仪器 高效液相色谱仪，(天津兰博仪器有限公司)；固相萃取小柱，Cis；RE-52AA 型旋转蒸发仪，(上海亚荣生化仪器厂)；TD4A 型离心机，(长沙英泰仪器有限公司)；KQ-500DE 型医用超声波清洗器，(昆山市超声仪器有限公司)；TG328B型电子天平，(上海天平仪器厂)。 1.4 色谱条件 流动相：甲醇+水=45+55。 流速：1mL/min。 紫外检测波长：244nm。 进样量：20pL。 色谱柱：C8。 1.5 实验过程与方法 1.5.1 盐酸克伦特罗标准曲线的制作 盐酸克伦特罗标准使用溶液：取盐酸克伦特罗标准品2.0mg 置2mL容量瓶中，加甲醇+水(45+55)溶液溶解并稀释至刻度。配成浓度约1.0mg/mL的标准贮备液。 取贮备液依次于2mL容量瓶中加流动相定容，配成浓度分别为 0.05mg/mL0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL的盐酸克伦特罗稀释液。 各取 20p.L进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵轴作标准曲线。 1.5.2 固相萃取法制备样液 称取绞碎的肉类样品5.0000g于50mL锥形瓶中，用乙醇 30mL分3次进行超声提取，每次5min，将提取液合并水浴70℃蒸发至约2mL。取固相萃取柱(SPE)，先用甲醇和水各2mL处理 SPE 小柱，再将浓缩提取液约2mL 及少许乙醇清洗液过柱，用甲醇(10+90)淋洗液 2mL淋洗，最后用甲醇2mL 洗脱，收集甲醇洗脱液，于室温中挥发至近1mL，用甲醇重新溶解定容至 2mL 供测定[8，9]。 1.5.3 液相萃取法制备样液 取10.0000g绞碎肉试样，加20mL 0. 1mol/L 高氯酸匀浆，超声 20min/80℃加热 30min，冷却后离心(3 950r/min)15min。沉淀加 5mL 0.1mol/L高氯酸洗涤、离心，将上清液液并，用1mol/L氢氧化钠调pH值至9.5，加8g氯化钠，混匀，加入25mL异丙醇+乙酸乙酯(40+60)，振荡提取 20min。再用20mL混合溶剂重复萃取，合并有机相，60℃旋转蒸发至干。用0. 1mol/L 磷酸二氢钠缓冲液(pH值6.0)溶解并定容至10mL110J。 1.5.4 测定 取制得的的液各 20pL 进样测定，得出结果进行分析。 1.5.5 空白对照试验 对应于固相萃取法和液相萃取法两种方法制备样液过程，同时采取不加试样，其他都相同来制备空白样液，进行同等实验，评价方法的准确性。 1.5.6 精密度实验 在实验操作和环境条件一致的情况下，取同一标液进行5次平行试验，计算变异系数，评价方法的精确性。 1.5.7 回收率试验 精密称取已知含量的不同样品5份，每份5.0000g，分别加入定量的克伦特罗0.5mg，按供试品溶液制备方法制备后，进行测定，测得各个样品的回收率，以此来评价分析方法和测量系统准确性。 2 实验结果与分析 2.1 标准样品色谱图 如图1所示，结合标准品的线性关系，可知峰1为克伦特罗，保留时间是5.561。 图1 克伦特罗标准品含量为1.0mg/mL的色谱图 北京豫维科技有限公司联系系 水先生电话：18911849923 表1 不同浓度的克伦特罗标准品所得到的峰面积 浓度(mg/mL) 峰面积(mv.s) 0.0000 0 0.0500 1217 0.1250 2752 0.2500 7554 0.5000 17508 1.0000 35603 2.2 标准曲线 以克伦特罗峰面积(Y)对标准溶液浓度(X)进行线性回归处理，回归方程为：Y=33128X-408.28，R’=0.9966(n=5)，表明在克伦特罗在0.0500~1.0000mg/mL的范围内线性关系良好(见图2)。 图2 克伦特罗标准曲线 2.3 样品色谱图 如图3、图4所示，结合所有样品色谱图，由定性试验分析可知，所有样品及空白对照实验均未检出克伦特罗色谱峰。 图3 固相萃取法中样品1的色谱图 2.4 样品中克伦特罗含量 由于所有试样均未检出克伦特罗色谱峰，所以未检出克伦特罗的含量。 2.5 精密度实验 见表2. 图4 液相萃取法中样品1的色谱图 表2精密度实验结果 伦特罗 标准品 第1次 第2次第3次 第4次第5次 RSD (%) 峰面积(mv.s) 17508 17425 17304 17653 17561 0.76 2.6 回收率实验 见表3. 表3 回收率实验结果 样品 加标前克伦特 加标量/(mg/g. 加标后克伦特 回收率/(%) 序号 罗含量/(mg/g) 罗含量/(mg/g) 0.0000 0.5000 0.5050 101 2 0.0000 0.5000 0.5100 102 3 0.0000 0.5000 0.5000 100 4 0.0000 0.5000 0.4965 99.3 5 0.0000 0.5000 0.4970 99.4 2.7 讨论 (1)实验结果发现采用高效液相外标定量法，以Cg为分析柱，选择甲醇+水(45+55)、色谱纯甲醇、甲醇磷酸(1+99)溶液(75+25)为流动相，标准品中克伦特罗成分出现不同的峰形和标准曲线。 所测的三种流动相下标准色谱图比较见图5至图7. 图5 流动相为甲醇磷酸(1+99)溶液(75+25)的标准色谱图 此流动相下的克伦特罗出峰峰形变态，无法分离。 图6汤流动相为甲醇+水(45+55)的标准色谱图 此流动相下克伦特罗出峰峰形尖锐，分离较好，而且线性关系良好。 图7流动相为色谱纯甲醇的标准色谱图 此流动相下克伦特罗出峰峰形尖锐，分离较好，但线性关系很差。综合峰形和线性关系考虑，因此测定时选择的最佳流动相是甲醇+水(45+55)。 (2)根据标准色谱图和线性关系能够定性判断克伦特罗标准品的保留时间是5.561，从而可以判断样品中是否有克伦特罗成分出峰，即可以得出实验结果所有样品均未检出克伦特罗。 (3)由于缺少弱阳离子交换柱，所以本实验无法与国标法进行比较。但就两种不同的前处理试样法，可以发现固相萃取法较液相萃取法，省试剂，省时间，操作方便，可以用于大量生产中的快速检测。 (4)实验所测结果有可能存在偏差，由于克伦特罗属于激素类，性质不稳定，在前处理过程中，试样消解与萃取不充分、各种挥发及化学性质的改变都会影响实验结果。 3 结论 (1)应用高效液相色谱法对五种样品中克伦特罗进行测定，实验结果表明所建立的方法是可行的。 (2)此方法的平均回收率为100.34%，变异系数为0.76%，具有较好的准确性和精确性。 (3)所测这五种样品中克伦特罗含量均为零，所以还是可以判断这五种猪、牛、羊冷冻肉制品在瘦肉精方面还是比较安全的。 ( 参考文献 ) ( 1 李正明.食品安全体系的建立与运作[J].食品与机械， 2002，(2)：4~5 ) ( 2 宋莉晖，杨成对.克伦特罗残留的分析方法研究[J].食品 科学，2005，26(1 ) ：187~190 ) ( 3 陈小鸽.克伦特罗探究与分析[J].河南畜牧兽医，2001， (7)：32 ) ( 4 张力，郑中朝.饲料添加剂手册[M].北京：化学工业出版 社，2000：32~46 ) ( 5 Schlupp A . ， Anielski P.， Thieme D.， e t al. 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