猪肉中瘦肉精的残留检测方案(毛细管柱)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923中国卫生检验杂志2016年11月第26卷第21 期 Chin J Health Lab Tec， Nov. 2016， Vol. 26， No. 21·3089· 高效薄层条带快速净化检测猪肉中瘦肉精的残留 滕卫林'，陈咪佳，吴俊，张宜明 1. 杭州市疾病预防控制中心，浙江杭州310021；2.浙江农林大学，浙江临安311300；3. 临安市疾病预防控制中心，浙江临安311300 摘要：目的 本实验利用薄层净化与气质联用仪相结合技术，建立了快速检测动物组织中残留瘦肉精的方法。方法 通过优化薄层展开程序，获得瘦肉精在自制的纸基薄层板上稳定的比移值(Rf)。样品经过提取、浓缩后，在纸基薄层板上进行净化，通过裁切目标区，以甲醇洗脱，洗脱液经衍生剂反应后，用气质联用仪，在 SIM 模式下检测定量。结果 在优化条件方法下，样品中的杂质得到完全分离。在浓度范围为0.02 pg/ml~0.5 pg/ml时，线性关系良好，线性回归方程为y=358 971x+18 441，r=0.9992；加标回收率为71.3%~84.7%(外标法)，最低检出限为2.0 pg/kg(基于3倍信噪比)。结论 本方法操作快速方便、灵敏准确，能满足猪肉样品中瘦肉精的快速分析要求。不仅节约了前处理时间，更有效地降低了溶剂消耗，表现出环境友好等特点。纸基薄层色谱条带有望在农产品样品前处理领域获得良好应用。 关键词：薄层色谱；瘦肉精；净化；气相色谱-质谱 中图分类类：0657 文献标识码： A 文章编号：1004-8685(2016)21-3089-04 Rapid detection of clenbuterol residues in pork with high performancethin layer clean -up technique TENG Wei -lin"，CHEN Mi -jia， WU Jun， ZHANG Yi -ming Hangzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention， Hangzhou， Zhejiang 310021， China Abstract： ObjectiveTo establish a method to rapidly detect clenbuterol residues in pork tissues with high performance thinlayer clean - up technology and gas chromatography mass spectrometry ( GC-MS). Methods Throughout optimization of sol-vent development procedures， the stable Rf value has been obtained on the surface of paper -based thin layer chromatographyslides. The sample was extracted and concentrated for purification on paper - based thin layer. Consequently， the target zonewas cut with methanol for elution， and the elution solution， after derivation， was detected by GC- MS instrument under SIMmode. Results In this optimized method， the impurities in the sample were completely separated. And when the concentra-tions were within 0.02 pg/ml-0.5pg/ml， good linearity was obtained； linear regression equation was y=358 971x+18441，r=0. 999 2， with the recovery rates within 71.3% -84.7%， and the minimum detection limit as 2.0 pg/kg. Conclu-sion The method is fast and convenient， sensitive and accurate， and can meet the requirement of rapid analysis of clenbuterolin pork samples. The method not only saves the pre -treatment time， but also more effectively reduces the solvent consumption，showing the characteristics of environmental friendliness. Thus， current constructed paper - based thin layer chromatographyslides is expected to be applied in the sample pretreatment field of agricultural product. Key Words： Thin layer chromatography； Clenbuterol； Clean -up； Gas chromatography mass spectrometry 瘦肉精是一类能促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的化学物质，在我国瘦肉精一般指克伦特罗(Clen-buterol) ，其正式名为盐酸克伦特罗，化学名称为α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氧苯甲醇盐酸盐，简简克伦特罗，又名克喘素、氨氨哮、氨必妥、氨双氯喘通，为白色结晶状粉末，味略苦。 目前，普遍的净化方法是固相萃取柱法，该方法 ( 基金项目： 浙江省 医药 卫生 一 般研究计划(20 1 3 KYA171) ) ( 作者简介：滕卫林(1976 -)，男 ，硕 士 ， 副主 任 检 验技 师 ， 主 要 从 事 理 化检 验工作。 ) 的经济成本较高，对样品的预处理过程较为繁琐且溶剂消耗量较大，耗时较长2-31。检测平台有气相色谱-质谱联用或者液相色谱-质谱联用方法4-，综合而言，样品的前处理非常耗时费力，难以及时应对突发性食物中毒的快速分析。已有报道薄层层析可用于猪肝中的瘦肉精分析，但其分析的灵敏度不能满足有关要求。鉴于此，本实验采用薄层净化方法实现了样品的快速净化，简化了实验过程，不仅可以在同一块薄层板上进行多样品的同时点样，而且可以以条带点样方式加大上样量，简便省时。猪肉样品经粉碎、提取、浓缩、争化、洗脱、衍生等处理后，可以迅速得到满足气相色谱-质谱法(GC-MS)检测的最终样 品。通过薄层板净化与未经薄层板净化的样品质谱图对比，分析薄层板的净化效果是否满足对样品检测的需求。 材料与方法 1.1 样品 猪肉样品于4月上旬采购于临安浙皖农贸城，经粉碎后，保存于-20℃冰箱中。 1.2 仪器与试剂 气质联用仪(GC -MS -PO2010，岛津制作所，日本)；电子天平(BS-210S，深圳深美仪器有限公司，中国)；旋转蒸发仪(IKA RV10，IKA -Werk 仪器设备有限公司，德国)；高速冷冻离心机(Thermo X1R，赛默飞科学仪器有限公司，美国)；氮吹仪(N-EVAPTM 111， Organomation 实验辅助设备公司，美国)；小型离心机(IKA miniG，IKA - Werk 仪器设备有限公司，德国)；涡旋混匀机(IKA MS3，IKA-Werk 仪器设备有限公司，德国)；SP-H型电动点样器(上海科哲生化有限公司)；进样瓶若干。甲醇、乙酸乙酯、乙酸、甲苯、衍生剂：N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺( BSTFA)、克伦特罗标准品(1.0 mg/ml)。将自制纸基硅胶Go薄层板裁切为长5 cm，宽2.2 cm。上、下各距边缘0.5 cm画线标记点样区和溶剂前缘区，因此展距为4cm。 1.3 方法 1.3.1 仪器条件 1.3.1.1 色谱条件 色谱柱 Rxi -5 ms 毛细管柱(30 mx0.25 mm，0.25 pm)；优化后的色谱条件，升温程序：初温120℃，保持3 min，然后以 10℃/min 升至230℃，保持5 min，再以 10 ℃/min 升至280℃保持5 min。载气：氦气，纯度为99.999%，恒压模式；进样量：1.0 p.l；进样方式：不分流进样。 1.3.1.2 质谱条件 离子源温度为230℃；辅助接口温度为250℃；溶剂延迟10 min；扫描方式：选择性离子的 m/z 是选择离子监测方式；选择离子为86、243、262，其中定量离子为86。优化条件下浓度为0.1 pg/ml瘦肉精经衍生后标准的选择离子流图(图1)。 图1 0. 1 pg/ml瘦肉准标准选择粒子流图 1.3.2 薄层板预处理与展开瓶 展开剂配制：展开剂配比为乙酸乙酯：甲醇：乙酸=8：1：0.8。展开瓶：在磨口广口瓶瓶底铺上一层海砂，海砂上放置一张适当大小滤纸片，滤纸片大小以广口瓶瓶口外沿大小为基准。薄层板预处理：薄层板用镊子夹取，使用 前先于展开剂中展开一次。展开结束后，用托盘盛放，在80℃电热鼓风干燥箱中，烘烤30 min，取出备用。 1.3.3 薄层板目标区的定位 点样：精确移取50 p.l克伦特罗标准品(1.0 mg/ml)，用点动点样器在0.5 cm画线位置进行条带点样。展开与烘干：在展开瓶中加入适量展开剂，展开剂液面以低于点样位置高度为准。将点样完成的薄层板放入展开瓶中，薄层板应直上直下，避免倾斜，盖上瓶塞，等待展开完成。将已展开完成的薄层板从展开瓶中取出，放置于自动点样器上加热烘干表面残留的展开剂。裁切与洗脱：用镊子夹取已烘干的薄层板，放置于托盘上，以3.2 cm为基准，上下±2 mm，即以4 mm 为间隔，连续裁切下5个条带，分别放置于1.5 ml加塞离心管中，并加入0.5 ml甲醇进行初次洗脱，并做好标记。将初次洗脱液，在60℃下进行氮吹，直至吹干。在离心管中再次加入0.5 ml 甲醇，进行二次洗脱，洗脱后，取出条带，二次洗脱液备用。衍生：在60℃下，将二次洗脱液氮吹至干。将吹干物置于80℃烘箱中，烘烤1 min ~2 min，烘干剩余水分。在离心管中，分别加入100 p.l衍生剂与100 pl甲苯，加塞后于涡旋混合器充分混匀。在80℃烘箱中，恒温衍生60 min， 衍生结束后，取出，氮吹至干，加入甲苯0.5 ml 溶解吹干物，供GC-MS检测110-121。标准品衍生：精确移取适量体积克伦特罗标准品(1.0 mg/ml)，逐级稀释后按相同方法与洗脱液进行同步衍生。目标区定位：将克伦特罗标准品与点板洗脱液衍生后的离子质谱图进行对比，确定克伦特罗在该实验条件下，薄层板上展开后的目标区，确定比移值(R)。 1.3.4 样品的提取 空白样品：称取样品5g(精确到0.01 g)，置于50 ml 离心管中，加甲醇20 ml，在均质机上，以10 000 r/min 均质60 s，加盖，于-20℃冰箱中冷冻10 min，取出离心管，8000 r/min 离心10 min。移取上清液10 ml于25 ml鸡心瓶中，60℃下旋转蒸发至2 ml~3ml。将上清液转移至洁净10 ml离心管中，在60℃下氮吹至少于0.5 ml，转移至1.5 ml 洁净离心管中，用300 p.l 甲醇清洗 10 ml 离心管内壁2次，合并清洗液至 1.5 ml离心管中，加盖，于-20℃冰箱中冷冻2 min，取出离心管，离心1 min。将上清液转移至洁净1.5 ml 离心管中，在60℃下氮吹，至剩余0.5 ml ~0.8 ml，取下离心管，加盖，于-20℃冰箱中再次冷冻2 min， 取出离心管，离心1 min。将上清液再次转移至洁净1.5 ml 离心管中，在60℃下氮吹，至剩余100 p.l，加入100 p.l 甲醇，充分混匀，备用。加标样品：称取样品5 g(精确到0.01 g)，置于50 ml 离心管中，加甲醇20 ml，加不不同体积的克伦特罗标准品(2.0ug/ml)，按上述方法同步处理。加标样品的平行设置：按上述加标样品的处理方法，设置3组平行试验，计算其加标回收率。 1.3.5 样品的净化与衍生取上述空白样品与加标样品各100 p.l，分别在薄层板上进行条带点样。点样完成后，在展开瓶中进行展开。展开完成后，根据1.3.3中所确定的比移值，裁切目标区条带2 mm 宽，按照1.3.3洗脱步骤进行洗脱。洗脱液按1.3.3衍生方法进行衍生化，供 GC -MS 检测。标准品衍生：取100 p.l克伦特罗标准品(2.0 pg/ml)与样品洗脱液进行同步衍生，以此为基准，计算加标回收率。1.3.6 标准曲线的绘制 精确移取克伦特罗标准品(2.0 ug/ml)10 p.l 25 pl、50 pl、100 pl、250 pl分别加入1.5 ml离心管中，吹吹至干，按照上述衍生方法进行衍生，得到最终克伦特罗浓度为0.02 pg/ml、0.05 pg/ml、0.1 pg/ml0.2 pg/ml、0.5 pg/ml。经GC - MS 测定，以浓度为x轴、峰面积为y轴，绘制标准曲线。 2 结 果 2.1 薄层板预处理与展开瓶 由于薄层板表面会附着杂质，因此在点样展开前，需要对薄层板进行预展开处理，排除表面杂质，并于80℃烘箱中，烘烤活化30 min。常规展开所使用的展开缸体积较大，需要的展开剂体积大，展开体系内蒸汽不易饱和。本实验所采用的展开瓶体积小，展开所需的展开剂较少，蒸汽易饱和。展开瓶瓶底铺上一层海砂，海砂上覆盖一张圆形滤纸片，使展开瓶瓶底呈现水平状态，能够保证薄层板在展开瓶中以一种平直稳定的状态进行展开。2.2 薄层板目标区的定位 由于本实验所测定的克伦特罗为无色，因此在薄层板上展开后，需确定克伦特罗在乙酸乙酯-甲醇-乙酸体系下的比移值。根据所查文献，在该体系下，克伦特罗的比移值为0.81。由于展距为4 cm，因此克伦特罗迁移距离应为3.2 cm，以3.2 cm 为基准，上下±2mm，即每条条带宽4 mm，进行条带的连续裁切。分别裁切出5条条带，各条带在薄层板上的距离(以4cm展距在基准) 如表1所示。 表1各裁切条带在薄层板所对应的距离(以4cm展距为基准) 条带编号 条带在薄层板上对应的距离(cm) ① 3.4~3.8 ② 3.0~3.4 ③ 2.6~3.0 ④ 2.2~2.6 ⑤ 1.8~2.2 上述条带进行洗脱、衍生、GC-MS检测后得到克伦特罗的质谱图，与克伦特罗标准品直接衍生所得质谱图对比，最终确定克伦特罗在当前所用的纸基薄 层条上展开后，处于⑤号条带，得到比移值为0.5。 由上述结果可知，由于本实验所采用的薄层板为自制纸基硅胶 Go薄层板，所以克伦特罗在乙酸乙酯-甲醇-乙酸展开体系下迁移距离小于文献所述。不同薄层板所带来的比移值差距属于可控、可接受范围，以连续裁切方法进行薄层板目标区的定位是可行的 克伦特罗标准曲线与最低检出限 按上述实验方法，衍生后，供 GC - MS 检测的克伦特罗浓度为0.02 pg/ml、0. 05 pg/ml、0. 1 pg/ml、0. 2 pg/ml、0.5 pg/ml，线性回归方程为y=358 971x+18 441，r=0.9992(图2)，最低检出限为2.0 pg/kg。由此可见，克伦特罗在该实验条件下，在浓度范围为0.02 pg/ml~0.5 pg/ml时，线性关系良好。 图2 克伦特罗标准曲线 2.4 加标回收率与精密度 通过上述方法处理后，样品的加标量分别为20 pg/kg 和100 pg/kg，对样品中的克伦特罗检测结果进行计算，得出该方法的加标回收率以及相对标准偏差，如表2所示。该方法下，克伦特罗的加标回收率为71.3%~84.7%，证明以高效薄层净化-气质联用技术检测瘦肉精的方法，取代固相萃取柱净化是可行的。 表2 加标回收率和精密度(n=5) 组分名称 加标水平1 加标水平2 加标量 回收率 RSD 加标量 回收率 RSD (pg/kg) (%) (%) (pg/kg) (%) (%) 瘦肉精 20 77.1 6.1 100 79.5 5.9 20 81.2 100 78.5 20 84.7 100 83.8 20 77.3 100 71.3 20 72.0 100 75.6 2.5 薄层板的净化效果比对 猪肉样品经粉碎、提取、浓缩后，通过薄层板净化、洗脱、衍生，最终得到满足 GC -MS 检测要求的检测样品。通过经薄层板净化与未经薄层板净化的质谱图(图3)对比，得到薄层净化的效果，通过薄层净化后，样品中杂质明显被分离，因此可以得到满足后续检测条件的洁净样品。 注：A：争化；B：未净化。 图3 纸基薄层净化样品与未净化样品质谱总离子流图(TIC)对比 3 结 论 采用薄层条带净化的方法，建立了气相色谱-质谱联用仪检测瘦肉精的方法，尽管采用外标法，但本方法仍能够较保证实验的定量可靠性。在该方法下，样品杂杂得到基本分离，加标回收率为71.4%~72.3%，最低检出限为2 pg/kg。 本方法操作快速方便、灵敏准确，能满足猪肉样品中瘦肉精的快速分析要求。此外，该方法试剂消耗少，操作快速可满足瘦肉精大批量样品的检测要求。 ( 参考文献 ) ( [ 1 ] 吴 宁 鹏 ， 班 付国 ，周红 霞，等.浅谈气质联用测 定 盐 酸 克伦特 罗 [J ] . 中国畜牧兽医，2 00 6，33(10 ) ： 7 2-7 3. ) (上接第3088页) 3 结 论 本实验用乙腈-水作流动相，建立了 UPLC 测定酸奶中激素残留方法的研究。结果表明，本实验快速、简便、准确、灵敏，不仅能够完全满足日常的酸奶检测，并为进一步研究提供了帮助。 ( 参考文献 ) ( [ 1 ] 中 华人民共和国国家 质 量监督 检验 检疫总局. 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