乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的含量检测方案(液相色谱柱)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923食品工业科技分析检测-Vol.32，N0.06，2011 北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923食品技—分析检测 高效液相色谱法检测乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的含量 李静芳，张素文，彭美纯，彭 灿 (湖南亚华乳业有限公司，湖南长沙410200) 摘 要：建立用高效液相色谱法同时测定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖含量的方法。以乙腈-水(体积比75：25)为流动相，通过氨基柱分离和示差折光检测器测定四种糖的含量。在2~20mg/mL 范围内线性良好，果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖精密度分别为2.90%、1.41%、1.40%和2.79%，相应的回收率分别为94.96%、104.61%、104.56%和97.87%，此法具有快速准确的特点。 关键词：高效液相色谱，果糖，葡萄糖，蔗糖，乳糖 Determination of fructose，glucose，sucrose and lactose indairy products by high performance liquid chromatography LI Jing-fang，ZHANG Su-wen，PENG Mei-chun，PENG Can (Hunan Avadairy Corp.Ltd.，Changsha 410200，China) Abstract： HPLC method was established to determine the fructose，glucose，sucrose and lactose in dairy products.Thesefour kinds of sugars were simultaneously assayed on a NH， column by using a differential refract-meter detector anda mobile phase of acetonitrile-water(75：25).The linear range of this method ranged from 2mg/mL to 20mg/mL.Therelative standard deviation was 2.90% ，1.41%，1.40%，2.79% for fructose，glucose，sucrose and lactose respectively.Theaverage recovery was correspondingly 94.96%，104.61%，104.56%，97.87%.This method was proved to be accurateand rapid. Key words： HPLC； fructose； glucose； sucrose； lactose 中图分类号：TS252.7 文献标识码：A 文章编号：1002-0306(2011)06-0391-03 为了满足--些特殊人群对糖类的要求，乳制品中糖的含量和种类也有所不同，如适合于乳糖不耐症的低乳糖乳制品，适合于糖尿病人的低糖乳制品，添加果糖或葡萄糖以增强功能性、改善风味的乳制品等。因此建立快速、简便、准确的检测方法，对于准确测定乳制品中的果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖含量有着重要意义。另外，少数生产厂家为了降低成本在淡乳粉中掺入蔗糖等替代物，从而牟取不法之利，打击这种以蔗糖为添加物的造假行为，建立快速、准确的方法区分伪劣商品已成为当务之急。目前糖的分析方法有很多，如滴定法、比色法、电极法、色谱法等1，但前三种方法步骤繁琐，有的方法只能测定糖的单一组分。而高效液相色谱法2-51具有步骤简单、可同时测定多种组分、结果准确的优点，近年来被广泛用于糖类组分的分析。 ( 收稿日期：2010-05-17 ) ( 作者简介：李静芳(1984-)，女，工程师，主要从事食品分析方面的研究。 ) ( 基金项目：国家十一五支撑计划课题(2006BADO4A15)。 ) 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 亚铁氰化钾、乙酸锌 上海国药公司，分析纯；乙腈 美国 TEDIA公司，色谱纯；果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖 美国 Sigma 公司，标准品；水 均为一级水。 分析天平 感量 0.0001g，瑞士梅特勒-托利多公司； Waters2695)r高效液相色谱系统 配有Waters2414示差折光检测器，美国Waters 公司。 1.2 实验方法 1.2.1 样品处理 固体样品称取1.5~2.0g(液体样品则称取10.0g左右)精确至0.0001g，加入50mL 60℃左右的水充分溶解，再加入亚铁氰化钾溶液(浓度为150g/L)和乙酸锌溶液(浓度为300g/L)各1mL，静置 10min 后定容至100mL，滤纸过滤，取滤液用0.45 pum 的滤膜过滤至进样瓶中待上机。 1.2.2 标准溶液的配制 分别准确称取1.0000g左右的果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖标准品，用水溶解并定容至50mL，配成浓度为 20mg/mL 的标准储备液。 1.2.3 标准曲线 分别吸取糖标准液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00mL于10mL容量瓶中，用水稀释定容，分别吸20pL 注入高效液相色谱仪，以果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 1.2.4 色谱条件 色谱柱：氨基柱，250mm×4.6mm，5um；柱温：室温；流动相：乙腈：水=75：25；流速：1.0mL/min；示差折光检测器内温：40℃；进样量：20pL。 1.2.5 计算公式 x_CxV M 式中：X-样品中糖(果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖)含量，mg/g；C-滤液中糖的浓度， mg/mL；V-稀释体积，mL；M-样品质量，g. 2结果与分析2色谱条件的选择 2.1.1 色谱柱 色谱柱是高效液相色谱的核心，其分离效果将直接影响检测结果。常用于分离和测定糖类物质的色谱柱有氨基柱和钙基柱。 钙基柱是一种阳离子交换柱，通常只用于单糖、双糖及糖醇等低分子量糖的测定，在此法中不能将蔗糖和乳糖完全分离开，而且对于流动相及柱温的要求较高。氨基柱则是一种以吸附分配为主的氨基键合硅胶柱，可用于单糖、双糖及三糖等多糖的分析，通过调节流动相的比例能将果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖很好地分离开，与钙基柱相比还有成本较低和容易保养的优点。因此，在此方法中选用氨基柱来分离测定四种糖的含量。 2.1.2 流动相 通过调节流动相的配比来优化各组分的保留时间及分离度。分别用乙腈含量为70%、72%、75%、78%、80%的流动相进行了分离度实验。当乙腈体积小于75%时，果糖和葡萄糖分离度小于1.5，两个峰无法分开；当乙腈体积大于75%时虽然分离度大于1.5，但产生的能量过高使仪器报警，且各组分的保留时间较长。流动相配比为乙腈：水=75：25时分离效果最好，在20min 内能完成果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的分离和测定，分离结果见图1. 图1 果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的分离效果注：1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖；4.乳糖。 2.1.3 检测器 本方法选用的示差折光检测器是压力敏感和温度敏感型检测器，使用时必须注意保持泵压力的平稳和环境温度的恒定。另外，为了减少检测误差，检测器在使用前应先用流动相冲洗参比池。 2.2 线性关系及检出限 分别绘制果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的标准曲线，在2~20mg/mL范围内四种糖的浓度与峰面积线性关系良好，其线性方程及相关系数见表1。 以信噪比(S/N)为3计算检出限，结果见表1。 表1 果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的 回归方程、线性范围和检出限 糖 线性方程 线性范围 相关 检出限 (mg/mL) 系数 (mg/g) 果糖 Y=134357X-160 2~20 0.9991 1.05 葡萄糖 Y=110285X+15 2~20 0.9992 1.15 蔗糖 Y=126705X+72 2~20 0.9990 1.12 乳糖 Y=107033X-1448 2~20 0.9993 1.10 2.3 精密度 取一含果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖的牛乳样品，重复测定7次，计算相对标准偏差(RSD)，结果见表2。由表2可见，相对标准偏差均小于5%，说明方法的精密度良好。 表2精密度实验(浓度，mg/g) 次数 果糖 葡萄糖 蔗糖 乳糖 1 18.32 43.96 56.58 287.33 2 19.65 44.57 58.11 284.01 3 18.28 44.54 57.11 286.67 4 19.51 43.90 57.53 285.57 5 18.57 45.01 56.68 302.56 6 18.90 43.65 57.07 302.53 7 18.67 43.19 56.39 286.78 平均值 18.84 44.12 56.93 290.78 RSD(n=7，%) 2.90% 1.41% 1.40% 2.79% 牛乳样品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的分离色谱图见图2。 图2 牛乳中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的分离色谱图注：1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖；4.乳糖。 2.4 回收率 取一已知糖含量的牛乳样品，分别添加0.2g和0.5g左右的果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖标准品，每一梯度取3个样，测定方法的回收率，结果见表3。从表3可知，回收率在95%~105%之间，表明此法准确度较高。 表3 回收率实验(%) 添加梯度(g) 果糖 葡萄糖 蔗糖 乳糖 0.2 94.82 104.59 105.22 97.20 0.2 95.52 104.08 106.17 95.10 93.61 104.45 107.28 95.20 94.20 105.02 103.49 99.60 95.39 105.19 104.57 102.50 96.24 104.33 100.62 97.60 平均值 94.96 104.61 104.56 97.87 食品科技 分析检测- 3 结论 传统的糖测定方法针对性较差、步骤繁琐，国标中也只有高效液相色谱法同时测定乳品中乳糖、蔗糖的方法61，而本方法还可以同时测定乳制品中的果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖含量，具有快速简单、结果准确、灵敏度高的特点，对乳制品企业的生产和质量控制有实际意义。 ( 参考文献 ) ( 1 ] 宁正祥.食品成分分析手册M] . 北京：中国轻工业出版 社，1998：32-34. ) ( 2 ] 赵仁邦，刘孟军，葛微，等.高效液相色谱法测定枣中的糖 ) ◆ ◆川◆◆小◆川◆ 小 (上接第319页) 反应时间(h) 图4不同反应时间对酯化率的影响 间的接触面积增大，使酯交换反应产物均匀；另一方面还可以使传质均匀，有利于酯交换反应的进行。由图5可以看出，随着搅拌速度的提高，酯化率明显增加。但由于实验室条件所限，600r/min为最大搅拌速度。因此，选择600r/min 为最佳搅拌速度。 搅拌速度(r/min) 图5不同搅拌速度对酯化率的影响 2.2 正交实验 根据单因素实验的结果，得出影响酯化反应的主要因素，即反应时间、甾醇浓度、酶用量、搅拌速度。选用L，(3*)正交表进行正交实验，反应时间为3h，确定最佳反应条件，以得到酯化率较高的油脂制品。因素水平表见表1，正交实验结果见表2。 表1 正交实验因素水平表 因素 水平 A反应温度 B甾醇浓度 C酶用量 D搅拌速度 (℃) (g) (g) (r/min) 90 0.9 400 2 100 500 3 110 600 从表2中可以看出，A，B.CD，为最佳条件，即：反应温度100℃、在植物甾醇浓度5%、酶用量1%、搅拌速度600r/min。各因素对甾醇酯化反应的影响主次顺序为：甾醇浓度>反应温度>酶用量>搅拌速度，按照 ( 类物质J].食品科学，2004，25(8)：138-142. ) ( 3]莫海涛，李永库，潘发用，等.高效液相色谱-激光蒸发光散射检测法测定低蔗糖食品中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖含 量[J].食品工业科技，2006，27(3)：186-187. ) ( 4 ]Wang Xinmin，Zhang Ruili.Determination of glucosamine and lactose in m ilk - b ased f o rmulae by hi g h - performance liq u id c h romatography JJ J .Journal of Food Composition a nd A nalysis， 2008(21)：255-258. ) ( 5]刘玉峰，李黎.高效液相色谱法测定食品中的单糖、双糖 J ].食品科学，2007(3)：293-296. ) ( 6] GB5413.5-2010婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定 [ S] . ) 得到的最佳条件进行实验，酯化率为89.7%。 表2 正交实验结果 实验号 A B C D 酯化率(%) 1 1 1 1 1 85.9 2 1 2 2 2 77.3 3 1 3 3 3 72.6 4 2 1 2 3 89.7 5 2 2 3 1 77.1 6 2 3 1 2 73.9 7 3 1 3 2 85.0 8 3 2 1 3 75.8 9 3 3 2 1 72.1 k 78.600 86.867 78.533 78.367 k2 80.233 76.733 79.700 78.733 k， 77.633 72.867 78.233 79.367 R 2.600 14.000 1.467 1.000 3 结论 本实验所介绍的方法，反应过程中无对人体有毒有害化学试剂的使用，有效避免了试剂残留对人体健康影响的问题，使甾醇制品更加安全、放心。植物甾醇酯制品可以很好地添加到食品、油脂中，不仅满足人们的营养需求，更具有保健功能。 通过单因素与正交实验综合分析，最终确定最佳反应条件：植物甾醇浓度5%，酶用量1%，反应时间3h，反应温度100℃，搅拌速度600r/min，酯化率为89.7%。 ( 参考文献 ) ( 1] FERNANDESP， CABRA L J J1 M1 S Phytosterols：applicationsand recovery methods J ] . 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