乳粉中异构化乳糖的含量检测方案(液相色谱柱)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：189118499232016， Vol.39 No.I 乳业科学与技术※分析检测 北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923※分析检测2016， Vol.39 No.1Journal of Dairy Science and Technology12 高效液相色谱法测定乳粉中异构化乳糖的含量 刘丽君，李素琴，赵 贞*，岳虹，李翠枝，邵建波 (内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特 010110) 摘 要：建立乳粉中异构化乳糖高效液相色谱的测定方法。采用盐酸沉淀蛋白，氨基色谱柱分离，流动相为80%乙腈溶液， 示差检测器检测。每100g乳粉中异构化乳糖添加量为0.3~2.0g时，回收率97.4%~103.0%。定量检出限为0.3 g/100 g。该方法操作简便，检测准确，可用于乳粉中异构化乳糖的检测。 关键词：高效液相色谱法；异构化乳糖；乳粉 High Performance Liquid Chromatography Determination of Lactulose in Milk Powder LIU Lijun， LI Suqin， ZHAO Zhen*， YUE Hong， LI Cuizhi， SHAO Jianbo (Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd.， Hohhot 010110， China) Abstract： A method for the determination of lactulose in milk powder by high performance liquid chromatography (HPLC)was developed. Lactulose was extracted with water. The analysis was performed on a NH， column using 80% acetonitrile inwater as the mobile phase. The recovery of lactulose spiked into milk powder in the range of 0.3-2.0 g/100 g was 97.4%-103.0%. The limit of detection was 0.3 g/100 g. The results indicated that this method is accurate， simple and suitable for theanalysis of lactulose in milk powder. Key words： high performance liquid chromatography (HPLC)； lactulose； milk powder 中图分类号： TS252.7 文献标志码： A 文章编号：1671-5187(2016)01-0011-03 DOI：10.15922/j.cnki.jdst. 2016.01.004 引文格式： 文丽君，李素琴，赵贞，等.高效液相色谱法测定乳粉中异构化乳糖的含量[J].乳业科学与技术， 2016，39(1)：11-13.DOI：10.15922/j.cnki.jdst. 2016.01.004. http：//rykj.cbpt.cnki.net LIU Lijun， LI Suqin， ZHAO Zhen， et al. High performance liquid chromatography determination of lactulose in milk powder]Journal of Dairy Science and Technology， 2016， 39(1)： 11-13. DOI：10.15922/j.cnki.jdst. 2016.01.004. http：//rykj.cbpt.cnki.net 异构化乳糖，又称乳酮糖和乳果糖"，研究表明，异构化乳糖具有促进双歧歧菌增殖12~，改善肠道菌群7，防止便秘，增强机体免疫8-11，促进人体对钙、镁的吸收等作用21，因此异构化乳糖可广泛用于保健食品中，可添加到乳饮料、碳酸饮料、果汁饮料、糖果、乳粉等食品中作膳食疗效食品，也可单独作医疗用品3.15. 目前，测定异构化乳糖的方法包括分光光度法116-17、液相-质谱法8]、离子色谱法119.211、薄层色谱法I22-23]、液相色谱法(24-261等。分光光度法前处理复杂结果易受干扰，检测需要多种酶试剂费用高，对人员要求较高；液相-质谱法和离子色谱法定量准确，但是仪器价格昂贵或普及率低，不便于日常监测；薄层色谱法灵敏度低，只能作半定量分析，不能准确定量；以上方法均不便在实际检测中应用。本实验建立液相色谱检测异构化乳糖的方法 ( 收稿日期：2015-09-11 ) 具有准确、快速、成本低等特点，是目前检测异构化乳糖的理想的方法。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 婴幼儿配方乳粉 内蒙古伊利集团。 乙腈(色谱纯) 德国CNW科技公司；盐酸(优级纯) 天津市化学试剂三厂；异构化乳糖标准品美国Sigma公司。 1.2 仪器与设备 1260型液相色谱仪(带示差检测器) 美国Agilent公司； AB265-S型分析天平 瑞士Mettler-Doledo(上海)公司； GE013型超声清洗器 昆山超声仪器有限公司。 ( 作者简介：刘 丽 君(1972一)，女，高级工程师，本科，研究方向为乳制品品质安全监控。 E-mail： liulijun@yili.com ) ( *通信作者：赵贞(1983一)，女，工程师，硕士，研究方向为乳 品 检测：E-mail： jtzhaozhen@vili.com ) ( 万方数据 网址： Www. y uweichina. com 邮 箱wa ter1102@163. com ) 1.3 方法 1.3.1 色谱条件 色谱普：氨基柱(250 mm×4.6 mm， 3 um)； 流速：：1mL/min；进样量：20uL；柱温：40℃；流动相为乙腈：水=80：20(V/V)。 1.3.2 标准溶液配制 异构化乳糖储备液(10mg/mL)：分别称取0.5g(精确至0.0001g)异构化乳糖标准品于50mL容量瓶中，用水溶解定容，4℃冰箱中保存。 异构化乳糖标准工作液：分别吸取异构化乳糖标准储备液0.3、0.5、1、2、5mL，用水定容到10 mL 容量瓶中。该标准系列质量浓度分别为0.3、0.5、1、2、5 mg/mL。临用前配制。 1.3.3 样品处理 称取5g样品， 加入15 mL 45~50℃水充分溶解、摇匀，超声10 min， 用4 mol/L盐酸溶液调pH值至4.60，将溶液定量转移到50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，摇匀后再超声10 min。混匀后经滤纸过滤，滤液再经0.45 p.m微孔滤膜过滤，供液相色谱分析。 1.3.4 乳糖含量计算 式中：x为样品中异构化乳糖含量/(g/100g)；p为试样待测液夜异异化乳糖的质量浓度/(mg/mL)；V为定容体积/mL；m为称样质量/g。 2 结果与分析 2.1 标准曲线、线性范围和检出限 将异构化乳糖标准工作液在上述色谱条件下测定，以标准溶液的质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，异构化乳糖的线性方程y=135 366.6x+1 449.8(0.999)。线性范围为0.3~2.0g/100g。按照信噪比 (RSN)=10计算得出3种异构化乳糖的定量检出限为0.3 g/100 g。 异构化乳糖标准品和样品色谱图见图1~2。 图1 异构化乳糖标准品HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution of lactulose 图2 乳粉样品HPLC色谱图 Fig.2 HPLC chromatogram of milk powder 由图1可知，异构化乳糖保留时间分别为13.820 min；由图2可知，乳粉样品中异构化乳糖保留时间分别为13.787 min。 2.2 方法的回收率和精密度 在空白乳粉样品中分别添加不同量的异构化乳糖，进行回收率实验，平行测定6次，结果见表2. 表2 空白样品添加回收率结果 Table 2 Recoveries of lactulose spiked into blank sample 添加量/(g/100g) 0.3 1 2 平均回收率/% 103.0 97.4 101.0 表3 乳粉样品精密度结果 Table 3Precision for replicate determinations of milk powder 项目 精密度/(g/100g) 相对标准偏差/% 异构化乳糖 0.416、0.428、0.416、0.425、0.424、0.422 1.17 由表2可知，每100g牛乳中异构化乳糖添加量为0.3、1、2g时，异构化乳糖平均回收率为97.4%~103.0%，由表3可知，对添加300 mg/100 g异构化乳糖的样品分别进行6次重复性实验，相对标准偏差分别为1.17%。 2.3 样品前处理优化 由于方法采用示差检测器，具有参比的特殊性，所以样品不宜选用重金属盐类或甲醇作为沉淀剂，这类沉淀剂导致样品峰型差，检测灵敏度低；选择水溶解样品，盐酸调pH值沉淀蛋白，样品出峰稳定、峰型好、灵敏度高。 2.4 色谱条件的选择 选择粒径5p.m的氨基柱，调节流动相乙腈和水的比例，但出峰时间早，异构化乳糖和乳糖分不开，出峰时间晚可以分开但是峰型展宽，灵敏度降低，为了保证灵敏度和较短检测时间选择柱效高的3u.m粒径的氨基柱，在短时间内可以实现分离，检出限也达到要求。 选择70%乙腈溶液作为流动相，样品中异构化乳糖和乳糖的分离度不好，无法检测；调整为乙腈为90%时，异构化乳糖和乳糖可以分离，但出峰时间拖后至30 min以后，峰型展宽，也不利于准确定量；选择80%乙腈可使样品中异构化乳糖和乳糖分离度达到要求，而且 在20 min内出峰，峰型较好，可准确定量检测。最终选用80%乙腈溶液为流动相。 3 结 论 实验建立的乳粉中异构化乳糖检测方法，定量限为0.3 g/100 g， 在0.3~2.0 g/100g范围内有良好的线性关系，相关系数大于0.999，平均回收率为97.4%~103.0%，方法精密度相对标准偏差值为1.17%。本方法准确性、回收率和精密度满足定性、定量检测要求，为乳粉中异构化乳糖的检测提供理想的检测方法。 ( 参考文献： ) ( [1] 王野，徐清江.浅谈异构化液糖制造[J].饮料工业，2003，3(3)：32-34. DOI：10.3969/j.issn.1007-7871.2000.03.011. ) ( [2] 许本发.异构化乳糖促进肠道中双双杆菌增值作用的观察[J].中国 乳品工业， 1986，4(14)：104-108. ) ( [3] SEKI N， SAITO H. La c tose as a source f o r lactulose and other functional l actose derivatives[J]. I nternational Dairy Journal， 2012，22(2)： 110-115.DOI：10.1016/j.idairyj.2011.09.016. ) ( [4] ADEBOLA O O， CORCORAN O， MORGAN WA. Synbiotics： theimpact of p o tential p r ebiotics inulin， lactulose a n d la c tobionic acidon the survival a n d growth of l actobacilli pro b iotics[J]. Journal ofFunctional Foods， 2014， 10：75-84.DOI：10.1016/j.jff.2014.05.010. ) ( [5] TSUNESUKE T， YASUO N， TAKASHI K. Effect of yogurt andyogurt supplemented with Bifidobacterium and/or lactulose in healthypersons： a comparative study[J]. Bifidobacteria Microflora， 1991，10(2)： 1 23-130.DOI：10.12938/bifidus1982.10.2 _ 1 2 3. ) ( [6] BOVEE-OUDENHOVEN IM J， BRUGGENCATE SJMT，LETTINK-WISSINK M L G， et a1. Dietary fructo-oligosaccharides and lactulose inhibit intestinal c olonisation but stimulate translocation of Salmonella in rats[J]. Gut， 2003，52(11)： 1572-1578.DOI：10.1136/gut.52.11.1572. ) ( [7] OZER D， AKIN S， OZE R B. Effect of inulin and lactulose on survivalof Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum BB-02in Acidophilus-Bifldus yoghurt[J]. Food Science a nd TechnologyInternational，2005， 1 1(1)： 19-24. DOI：10.1177/1082013205051275. ) ( [8] AWAD R A， HAGRASS A E， SALAMA W M， et al. Lactuloseproduction f rom m i lk p e rmeate and it s p e rformance in he a lthyfunctional frozen y oghurt[J]. World Journal of Dairy and FoodSciences. 2014， 9(1)： 1-9. DOI：10.5829/idosi.wjdfs.2014.9.1.1127. ) ( [9] OLIVEIM RPRD S， FLORENCE A C R， PEMGO P， et a1. Use of l actulose a s prebiotic and i t s influence o n the growth， acidificationprofile and v iablecounts o f different probiotics in fermented skimmilk[J]. International Journal of Food Microbiology， 2011， 145(1)：22-27.DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2010.11.011. ) ( [10] PHAM T T ， SH A H N P. Effe c t of lactulose on biotransformation of isoflavone glycosides to aglycones in soymilk by lactobacilli[J]. J ournal of Food S cience， 2 008， 7 3(3)：158-165.DOI：10.1111/j.1750-3841.2008.00687.x. ) ( [11] 侯欣，孙学忠.乳果糖口服溶液改善脑卒中便秘67例分析[J].中国 误诊学杂志，2009，11(9)：2713. ) ( [12] van den HEUVEL E G H M， MUIJS T， van DOKKUM W， et al.Lactulose stimulates calcium absorption in postmenopausal women[J].Journal of Boneand Mineral Research， 1999， 14(7)：1 2 11-1214. DOI：10.1359/jbmr.1999.14.7.1211. ) ( [13] 王凤仙，刘博亚.异构化乳糖的生理功能及在食品工业中的 应用[J].中国食品添加剂，2015(5)： 179 - 182. DOI：10.3969/ i .issn.1006-2513.2015.05.022. ) ( [14] 黄萌萌，王加启，卜登攀.牛奶乳果糖的研究进展[J].中国乳品工业， 2007，35(6)：54-57. DOI：10.3969/j.issn.1001-2230.2007.06.014. ) ( [15] 张宗岩，侯万喜.异构化乳糖-新型婴儿食品添加剂[J].中国乳品工 业，1994，22(4)：168-170. ) ( [16] 黄萌萌.乳中乳果糖测定方法的优化及其在乳品质量评定中的应 用[D].北京：中国农业科学院，2007. ) ( [17] 关荣发，蒋家欣，刘东红，等.液态乳中掺有复原乳的乳果糖检 测方法[J].中国食品学报，2008，8(6)：161-164. DOI：10.3969/ i .issn.1009-7848.2008.06.028. ) ( [18] 胡强，徐红兵，李水军，等.液相色谱-串联质谱法测定尿中乳果糖、 甘露醇和乳糖含量[.中国现代医学杂志，2008，18(13)：1810-1813. ) ( [19] 曾文芳，时巧翠，陈永欣，等.离子色谱电化学测定牛奶中的乳 糖和乳果糖[J].食品科 学 ，2006，27(5)： 205-207. DOI：10.3321/ j.issn：1002-6630.2006.05.043. ) ( [20] 付晓伶，周荣耀，潘广文.离子色谱法测定大肠癌患者尿液中的甘 露醇和乳果糖[J].分析化学，2012，40(4)：608-611. ) ( [21] 邵泓，陆明，潘广文，等.乳果糖口服液中乳果糖及有关物质的高效阴离子交换色谱法测定[J].中国医药工业杂志，2010， 41(6)： 438-440.DOI：10.3969/j.issn.1001-8255.2010.06.011. ) ( [22] 刘芳，杨瑞金，张文斌，等.薄层色谱法快速分析乳果糖[J].食品 与发酵工业，2008， 3 4(1)： 119- 1 23. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2008.01.029. ) ( [23] 朱桂兰，童群义.薄层色谱法分析低聚乳果糖[J].食品工业科技， 2004，25(1)：131-132.DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2004.01.044. ) ( [24] 任一平，陈青俊，黄百芬.高效液相色谱示差折光法测定食品中的 乳果糖[J].中国乳品工业， 1997，25(4)：35-37. ) ( [25] 王凤仙，刘博亚.乳制品中异构化乳糖的色谱法检测研究进展[.乳业科 学与技术，2015，38(5)： 33-36. DOI：10.15922/j.cnki.jdst.2015.05.008. ) ( [26] 姜金斗，周红，张丽宏，等. HPLC法蒸发光散射检测器测定UHT灭 菌奶中乳果糖方法的研究[J].中国乳品工业，2006，34(3)：51-53. ) 数据'网址：www. yuweichina.com 邮箱watercom 建立乳粉中异构化乳糖高效液相色谱的测定方法。采用盐酸沉淀蛋白,氨基色谱柱分离,流动相为80%乙腈溶液,示差检测器检测。每100 g乳粉中异构化乳糖添加量为0.3~2.0 g时,回收率97.4%~103.0%。定量检出限为0.3 g/100 g。该方法操作简便,检测准确,可用于乳粉中异构化乳糖的检测。