月饼中丙烯酰胺的含量检测方案(液相色谱柱)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923食品研究与开发检测分析2013年7月第34卷第13期Food Research And Development 北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923陆文蔚，等：高效液相色谱法检测月饼中丙烯酰胺的含量检测分析-93_—— —92 DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.025 高效液相色谱法检测月饼中丙烯酰胺的含量 陆文蔚，黄玥，艾清，白晨* (上海商学院食品系，上海200234) 摘 要：研究了高效液相色谱测定月饼中丙烯酰胺的方法。采用 Inertsil ODS-SP(250 mmx46mm)色谱柱，以210 nm为检测波长，以5%乙腈水溶液作为流动相，流速为 0.8 mL/min，柱温25℃，进样量20 uL。该方法的最低检测限为0.124 u.g/kg。丙烯酰胺在 0.1 mg/L~1.0 mg/L 范围内呈良好的线性关系，回收率大于80%。结果显示：固相萃取与溶剂萃取都适合作为样品预处理方法，适合这类焙烤食品的检测。 关键词：丙烯酰胺；月饼；高效液相色谱法 Determination of Acrylamide in Moon Cake by High Performance Liquid Chromatography LU Wen-wei， HUANG Yue， AI Qing， BAI Chen (The Department of Food Science， Shanghai Business School， Shanghai 200234， China) Abstract： The method of high performance liquid chromatography for acrylamide determination in moon cakewas established. The acrylamide was separated on a Ci column(Inertsil ODS-SP，250 mmx46 mm) with 5%acetonitrile-water solution as mobile phase， and detected at 210 nm. The limit of detection is 0.124 pg/kg. Thelinear plots were obtained were obtained between 0.1 mg/L-1.0 mg/L. Overall recoveries were higher than 80 %and RSD value were between 0.17 % and 4.33 %. The experiment results showed that solid phase extraction andsolvent extraction were suitable for analysis of acrylamide in moon cake. Key words： acrylamide；moon cake；HPLC 2002年4月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学研究人员报道，在一些油炸和烧烤的淀粉类食品，如炸薯条、炸土豆片中检出丙烯酰胺"。淀粉类食品在高温(>120℃)烹调下容易产生丙烯酰胺2-3，大量动物试验证明其具神经毒性4，生殖毒性性，致癌性等。丙烯酰胺的形成与加工烹调方式、温度、时间有关，即使不同批次生产出的相同食品，其丙烯酰胺含量也有很大差异。挪威、英国、瑞士和美国等国家相继报道有关食品的丙烯酰胺含量，我国淀粉类食品非常丰富，烹调方式多样，其中焙烤、煎炸方式较多，科研人员对部分煎炸、烧烤等食品等进行了检测分析。食品中丙烯酰胺的检测已列为国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题，卫生部食品安全计划也将食品中丙 ( 基金项目：上海商学院校级教改项目(编号：253110)；中央财政支持地方高校发展专项资金项目(编号：YC1105-D-4-1) ) ( 作者简介：陆文蔚(1979 一 )，女(汉)，讲师，硕士，主要从事食品分析检测教学与科研工作。 ) ( *通信作者 ) 烯酰胺检测方法的建立和我国食品丙烯酰胺分布调查作为一个重要部分图。因此，本研究试图通过对月饼样品的 HPLC 检测，同时考察溶剂萃取与固相萃取对样品分析结果的影响，为传统焙烤食品丙烯酰胺的检测提供方法依据。有助于了解我国传统食品中丙烯酰胺的分布情况。 材料与方法 1.1 仪器、试剂与样品 1.1.1 仪器 岛津LC-20AD 高效液相色谱仪：岛津企业管理(中国)有限公司；HAMILTON 手动进样针：岛津技迩商贸有限公司；756CRT紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TDL80-2B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；XW-80A 微型旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司； WondaSep Cis固相小柱：岛津-GL商贸有限公公；HP01无油真空泵过滤装置：天津市恒奥科技发展有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海 恒一科技有限公司。 1.1.2试剂 乙腈(纯度≥99.9%，色谱纯)：德国默克化工产品；丙烯酒胺标准品(纯度99.9%，色谱纯)：阿法埃莎化学有限公司；甲醇(纯度≥99.8%，色谱纯)：国药集团化学试剂有限公司；正己烷(纯度≥97.0%，分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；超纯水。 1.1.3 样品 样品1(某苏式月饼)、样品2(某广式月饼)、样品3(油炸薯片)、样品4(非油炸薯片)：均购自超市。 1.2 方法 1.2.1 丙烯酰胺标准品的配制及工作曲线绘制 准确吸取丙烯酰胺标准彤备液(100mg/L)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于100 mL容量瓶中，纯水稀释至刻度，配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的丙烯酰胺标准工作液。以丙烯酰胺标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作出标准曲线，并且求得回归方程。 1.2.2样品的提取、纯化 取样品20g(月饼取面皮)，真空干燥，粉碎后的样品置于冰箱中保存。 1)溶剂萃取法：准确称取 2.5g样品，加入甲醇：水(1：1)溶液10 mL，漩涡振荡器混合后，3000 r/min 离心10 min，取上清液，残渣再用少量甲醇：水(1：1)溶液清洗2次~3次，离心，合并上清液。用 20 mL 正己烷分次洗入250 mL 夜液漏斗中，提取3次，收集提取液，然后用甲醇：水(1：1)溶液准确定量，经0.45 p.m滤膜过滤后，用于 HPLC 分析。 2)固相萃取法：准确称取 2.5g样品，加入纯水10mL，漩涡浴振荡器混合后，3000 r/min 离心 10 min， 取上清液，将残渣再用少量纯水清洗2次~3次，合并上清液，经0.45 pm 水系滤膜过滤，定量，备用。取Clg小柱，用甲醇、水进行活化。然后取样液3mL寸固相萃取小柱，洗脱液经0.45 u.m 滤膜过滤后，用于 HPLC 分析。 1.2.3 色谱条件 色谱柱为 Inertsil ODS-SP(250 mmx46 mm)色谱柱，以含5%乙乙水溶液为流动相，SPD-20A 型紫外检测器，柱温为25℃，流速为 0.8 mL/min，进样量为 20p.L。 1.2.4 定性定量方法 采用标准物质的保留时间对样品进行定性；定量方法是根据丙烯酰胺标准的浓度和色谱峰面积作出标准曲线，根据样品测定时丙烯酰胺的色谱峰面积计算出相应的提取液中丙烯酰胺的浓度，再经换算即可得到样品中丙烯酰胺的含量。 1.2.5 最低检出限的测定 对丙烯酰胺标准工作液进行稀释，对各浓度稀释液进行检测分析，确定能检出的最低浓度。用最低浓度标准溶液平行测定11次，得出标准偏差及方法标准曲线的斜率，计算最低检出限。 1.2.6 回收率实验 选择丙烯烯胺标准工作液浓度为 0.5 mg/L，样品及加标样品，经过净化、膜过滤后测定，计算回收率。 1.2.7 精密度实验 将浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L 的标准溶液按色谱条件重复测定6次，并取平均值计算精密度。 2 结果与分析 2.1 检测波长的确定 对丙烯酰胺标准溶液进行紫外光谱扫描，发现在210 nm 处有最大吸收峰，因此选择210 nm 为检测波长，紫外扫描光谱结果见图1。 图1 丙烯酰胺紫外扫描光谱图 Fig.11Ultraviolet spectrogram acrylamide of detected 2.2 丙烯酰胺标准物的保留时间 丙烯酰胺标准品色谱图见图2。 图2 丙烯酰胺色谱图 Fig.2 HPLC chromatogram of standard acrylamide 经测定，丙烯酰胺出峰时间为(5.640±0.007)min。 2.3 丙烯酰胺标准工作曲线及线性范围 丙烯酰胺工作曲线如图3所示。标准溶液浓度在0.1 mg/L~1.0 mg/L 范围内呈良好的线性关系，回归方 —94 图3 丙烯酰胺的工作曲线 Fig.3 Working curve of acrylamide 2.4 丙烯酰胺标准液的最低检测限 对 0.01、0.0080.006、0.004、0.002、0.001、0.0005 mg/L的丙烯酰胺标准溶液进行检测分析，结果表明浓度为0.01、0.008、0.006、0.004、0.002、0.001 mg/L的丙烯酰胺标样均能较好的检测出，浓度为 0.000 5 mg/L 的标羊则很难检测出。所以该方法最低检出限为 0.124 pg/kg。 2.5 样品检测色谱图 由于月饼等传统焙烤食品的基底复杂，有效的样品预处理方法对于可靠地分析结果至关重要。固相萃取近年来作为 HPLC 样品纯化的新方法，由于其快速、溶剂用量少等特点，备受关注。传统溶剂萃取法虽然操作比较繁琐，但试剂耗材比较简单，稳定性较高，同样适合常规实验室工作的开展。分别用两种方法进行纯化后，两种样品处理方法对样品分离效果的影响见图4~图7。 图4 样品1经过溶剂萃取后的色谱图 Fig.44HPLC chromatogram of sample 1 by solvent extraction 图5 样品1经过固相萃取后的色谱图 Fig.55 HPLC chromatogram of sample 1 by solid phase extraction 图6 样品2经过溶剂萃取后的色谱图 Fig.66HPLC chromatogram of sample 2 by solvent extraction 图7样品2经过固相萃取后的色谱图 Fig.7 HPLC chromatogram of sample 2 by solid phase extraction 如图5、图7所示，固相萃取作为纯化方法，色谱图中杂峰更少，样品中丙烯酰胺的色谱峰与杂质峰分离较好，峰型也较好。 2.6 样品检测结果的准确度与精密度实验 以回收率衡量方法的准确度，样品测定回收率的结果见表1。精密度实验结果见表2。 表1回收率测定结果 Table 1 Recovery of acrylamide in sample 样品编号 样品提取方法 丙烯酰胺含量/(mg/kg) 回收率/% 1 溶剂萃取 0.564 98.98 固相萃取 0.611 95.58 2 溶剂萃取 0.628 84.60 固相萃取 0.636 85.58 表2方法的精密度实验结果 Table 2 Precision of method 标液浓度/(mg/L) 测定次数 相对标准偏差/% 0.1 6 3.24 0.2 6 4.33 0.4 6 1.99 0.6 6 1.00 0.8 6 0.17 1.0 6 0.24 结果表明：两种提取纯化方法所得测定结果的回收率在80%以上，该色谱方法的相对标准偏差(RSD)在0.17%~4.33%之间。 两种提取方法的样品回收率进行t检验，样品1的ltl=3.873

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