中药中主要物质含量检测方案

Manon海能能仪 器民族仪器 品质典范 高效液相色谱-蒸发光散射检测法同时测定四君子丸中的5种有效成分 四君子丸为四君子汤的现代剂型，由党参、白术、茯苓、炙甘草组成，被《中华人民共和国药典》(2005版)收载[1]。现代药理学研究证明，四君子汤可增强机体的抵抗力，调节机体各方面的功能，对垂体、心血管功能、消化道运动功能和免疫功能有明显的改善作用[2]。四君子丸含有党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯II和白术内酯Ⅰ等主要活性成分[3-7]。对于党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯I和白术内酯Ⅰ的定量分析方法，已有的文献报道均是对其中的一种或两种成分进行测定[8-14]，i尚未见对上述5种活性成分同时测定的报道。按照药典[r的规定，对四君子丸的鉴定仅依靠薄层色谱法进行，结果比较粗放。本文对四君子丸中的上述5种活性成分同时进行了含量测定，可为四君子丸的全面质量控制提供实验依据。 1实验部分 1.1仪器与试药 LC7000高效液相色谱仪(海能仪器))，，包括LC7011输液泵， LC7070蒸发光散射检测器； HanonClatity色谱工作站。HIQ SIL Ci8V 色谱柱(250mm×44.6mm， 5 以m).。甲醇(色谱纯)，二次蒸馏水(自制)，冰醋酸(分析纯)；党参炔苷、苍术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸和甘草酸铵对照品；党参、白术、茯苓、甘草均购于济南漱玉平民药店；用于方法优化的四君子丸样品为自制，每丸平均质量为3. 0g，符合中国药典对丸剂的各项规定要求。测定的四君子丸实际样品分别为5个药品生产厂家的产品。 1.2对照品溶液的制备 分别精密称取党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ对照品适量，分别配制质量浓度为6.03，3.78，12. 24，3. 62，7. 80 g/L 的储备液。将上述5种储备液各取500pL混合、摇匀，即得含党参炔苷1.21g/L、茯苓酸0.76 g /L、甘草酸2.45 g /L、苍术内酯II0..772 g /L 和白术内酯Ⅰ1.56g/L的混合对照品储备液。 1..33供试品溶液的制备 取丸剂研碎，并称取1. 00 g， 加入乙醇15 mL， 超声提取30 min， 过滤。滤渣再重复提取2次。合并提取液并浓缩，转移至10mL 容量瓶中，用乙醇定容，摇匀；取其中1mL 于16000r /min 速率下离心10 min，上清液作为供试品溶液。 4色谱条件 色谱柱： HIQ SIL Ci8V 柱(250 mm × 4.6mm，5 um)1)；流动相：0.55%冰乙酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B；梯度洗脱程序：0-40 min， 80%A-20%A； 流速：：1.0mL /min； 进样量：10) uL；漂移管温度：55℃；喷雾器加热级别：60%；载气：氮气，压力0.2MPa；信号增益值：50。 2结果与讨论 21色谱条件的优化21..1检测器的选择 由于欲测定的样品中苍术内酯I和白术内酯Ⅰ的紫外吸收比较弱，且苍术内酯ⅢI含量较低，为了提高检测的灵敏度，本文采用蒸发光散射检测器检测。以信噪比(S/N)为指标，分别对蒸发光散射检测器的漂移管温度和载气压力进行了优化。结果在漂移管温度55℃、载气压力0.2MPa (30 psi)时，可以获得最佳的信噪比。 2.11.2流动相及洗脱程序的优化 本文的前期研究工作发现，四君子丸提取物的组成复杂，干扰成分多，欲测定的各组分的保留因子范围较宽，不适宜等度洗脱，因此选择了梯度洗脱。流动相分别选择甲醇-水(含冰乙酸)、甲醇-水(含磷酸)体 系进行梯度洗脱试验，相对来说，前者比后者的分离度好，灵敏度高。应用不同梯度陡度(T)的甲醇-水(含冰乙酸)体系进行试验的结果表明，在0 -40 min， 甲醇的体积比从20%升至80%，即T=0. 015时，可在40 min 内使所测定的组分分离。 为了考察冰乙酸的浓度对测定组分色谱行为的影响，在T=0.015条件下，分别用0~1.5%(体积分数)的冰乙酸进行梯度洗脱。结果表明，J9当以甲醇和0.5%冰乙酸水溶液为流动相时，各色谱峰的对称性较好，峰形尖锐，且各峰与相邻峰的分离度均大于1..22，所以选择了1.4节所述的流动相条件。 2..22系统的适用性 取供试品溶液10 uL进样，记录色谱图，党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯I和白术内酯Ⅰ的保留时间分别为7. .，11. 6，17.2，23.44 和26. 5 min， 各峰与相邻峰的分离度均大于1.2。供试品及对照品的色谱图见图1. 图1 (a)混合对照品和(b)供试品的色谱图 Fig. 1.Chromatograms of (a) a mixture of standardsand (b) a sample of Sijunzi bolus 1. lobetyolin；2. pachymic acid； 3. glycyrrhizic acid； 4. at-ractylenoide Ⅲ； 5. atractylenolide I. 2. 3方法学考察 2. 3.1线性方程、检出限及精密度 将对照品储备液稀释成不同的浓度，按前述色谱条件测定峰面积，分别以各分析物色谱峰面积(Y)的对数值为纵坐标、质量浓度(X， g /L) 的对数值为横坐标绘制标准曲线，得到党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ的线性方程、相关系数和线性范围(见表1)。取混合对照品储备液不断稀释后进样分析，以3倍信噪比确定检出限，结果见表1。 表15种分析物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及精密度(n=6) Table 1 Regression equations， linear ranges， correlation coefficients， detection limits and precisions (n=6) of the five analytes Analyte Correlation Linear Detection RSD (Intra-day)/% RSD (Inter-day)/% Regression equation range/ limit/ Peak Retention Peak Retention coefficient (g/L) (mg/L) area time area time Lobetyolin lg Y=1.406 lg X+8.647 0.9992 0.076-1.21 4.73 0.84 1.01 1.25 1.45 Pachymic acid lgY=1.287 lg X+6.302 0.9996 0.048-0.76 2.97 0.67 0.94 0.95 1.42 Glycyrrhizic acid lg Y=1.178 lg X+5.673 0.9997 0.153-2.45 4. 79 0.91 0.96 1.32 1.36 Atractylenoide Ⅲ lg Y=1.3431 lg X+6.854 0.9997 0.045-0.72 5.63 1.05 0.98 1.43 1.52 Atractylenolide I lgY=0.983 lg X+5.714 0.9995 0.098-1.56 6.09 0.98 1.07 1.29 1.65 * Y： peak area； X： mass concentration， g/L. 取一定浓度的混合对照品溶液，分别进行峰面积和保留时间的日内及日间测定的精密度(以相对标准偏差(RSD) 计)考察。在同一天连续进样6次，计算日内精密度；每份样品连续测定6d，计算日间精密度；结果亦列于表1。表1的结果表明，5种分析物峰面积和保留时间的RSD均较小，表明方法的重复性良好。 按1.3节的方法平行制备6份供试品，测定并计算5种有效成分的含量，党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ含量的RSD分别为2. 25%，1.87%，1.58%，1.65%和1.72%，表明方法的重现性良好。 2. 3.2供试品溶液的稳定性 取新制备的同一份供试品溶液，分别在室温下放置0，1，2，4，8， 12，24h 后进样分析。党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ峰面积的RSD 分别为1. 25%， 1.67%， 1. 19%，1.43%和1.38%，表明供试品溶液在24h内稳定。 2.3.3加标回收率 精密称取自制的丸剂12份，分分4组，每组3份。每组样品中分别精密加入混合对照品储备液0，20，50，100 uL，按所建立的方法进行供试品溶液的制备和测定，计算党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯I和白术内酯Ⅰ的含量，计算各组分的回收率，结果见表2。 表2样品中5种成分的加标回收率(n=3) Table 2Spiked recoveries of the five componentsin a sample (n=3) Added/ Found/ Recovery/ RSD/ Component mng mg % % Lobetyolin 0 0.628 一 1.53 0.121 0.747 98.57 1.59 0.302 0.928 99.56 1.41 0.603 1.227 99.34 1.86 Pachymic acid 0 0.123 1.46 0.076 0.198 98.99 1.98 0.189 0.312 100.17 1.23 0.378 0.501 99.96 1.47 Glycyrrhizic acid 0 2.967 1.34 0.245 3.212 100.25 1.23 0.612 3.573 99.04 1.65 1.224 4.156 97.13 1.52 Atractylenoide Ⅲ 0 0.016 1.36 0.072 0.087 99.64 2.04 0.181 0.192 98.43 2.18 0.362 0.350 97.26 2.44 Atractylenolide I 0 1.259 1.37 0.157 1.414 98.99 1.84 0.392 1.652 100.24 1.79 表2结果表明，所有组分的加标回收率在97.13%~100.25%范围内， RSD 均小于2. 44%，说明本方法准确可靠。 2.44 样品的测定 分别取5个厂家生产的四君子丸，按1.3节的方法操作，取供试品溶液10 uL进样分析，并计算丸剂中5种成分的含量，结果见表3。 表3四君子丸中5种有效成分的含量(n=3) Table 33Contents of the five effective components in Sijunzi bolus (n=3) Component Sample A Sample B Sample C Sample D Sample E Content/ RSD/ Content/ RSD/ Content/ RSD/ Content/ RSD/ Content/ RSD/ (mg/g) % (mg/g) % (mg/g) % (mg/g) % (mg/g) % Lobetyolin 0.664 2.24 0.689 2.12 0.594 2.10 0.46 1.88 0.528 2.35 Pachymic acid 0.095 2.28 0.102 2.00 0.101 2.28 0.131 1.74 0.140 2.05 Glycyrrhizic acid 3.303 1.68 1.928 1.74 2.064 1.73 2.119 1.79 3.570 1.33 Atractylenoide Ⅲ 0.004 1.78 0.008 2.06 0.009 1.57 0.010 1.61 0.007 1.41 AtractylenolideI 1.342 1.54 0.814 1.62 0.794 1.56 1.144 1.49 1.107 2.12 3结语 本文所建立的反相高效液相色谱-蒸发光散射检测梯度洗脱方法能够准确、灵敏地同时测定四君子丸中党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯I和白术内酯Ⅰ的含量，测定结果可靠，为四君子丸的质量控制提供了简单、有效的检测手段。