目的建立胸腺五肽分离纯化、分析鉴定方法,有效提高胸腺五肽含量。方法将标准Fmoc方法固相合成的胸腺五肽以Sephadex G225凝胶柱使粗肽脱盐,以循环制备液相色谱仪进行粗肽纯化,以质谱法进行分子质量的鉴定。结果该法得到胸腺五肽的纯度为99102% ,分子质量测定值与理论值相符。结论建立了高效、简便的胸腺五肽分离纯化方法,为工业化生产提供了实验依据。
第 19卷第2期2009年4月总88期中国药物化学杂志Chinese Journal of M edic inal Chem istryVol. 19 No.2 p. 126Apr.2009 Sum 88 第2期潘岳峰等:固相合成胸腺五肽的分离纯化与鉴定 固相合成胸腺五肽的分离纯化与鉴定 潘岳峰,韩静,张立军军,殷莉梅,张玥' (1.沈阳药科大学制药工程学院,辽宁沈阳110016; 2吉林敖东延边药业股份有限公司检测中心,吉林延边133700) 摘要:目的建立胸腺五肽分离纯化、分析鉴定方法,有效提高胸腺五肽含量。方法将标准 Fmoc方法固相合成的胸腺五肽以 Sephadex G-25凝胶柱使粗肽脱盐,以循环制备液相色谱仪进行粗肽纯化,以质谱法进行分子质量的鉴定。结果该法得到胸腺五肽的纯度为99.02%,分质质量测定值与理论值相符。结论建立了高效、简便的胸腺五肽分离纯化方法,为工业化生产提供了实验依据。 关键词:胸腺五肽;纯化;鉴定 中图分类号:R978.1 文献标志码:A Separation, pur ifica tion and iden tifica tion ofsolid pha se syn thesis thym open tin PANYue-feng, HAN Jing, ZHANG Lijun,YN Limei,ZHANG Yue (1. School of Phamaceutical Engineering, Shenyang Pha maceuticalU niversity, Shenyang 110016,China;2. The Center of D etection, Jilin Aodong Yanbian Phammaceutical Industry Co., L td, Yanbian 133700, China) Abstract:A in To construct the m ethod of separation, purifying and identifying m ethod of thym opentin, andto elevate effectually thym opentin content M ethods The thym opentin synthesized by solid phasestrategy, w asdesalted by Sephadex G-25, purified by recycling preparative HPL C, and identified by mass spectrum. Re-sults The purity of synthesized thym opentin was 99.02% and the molecularw eightm atched w ith theoretical-values Conclusion The highperfomm ance and convenientmethod of purifying thym opentin w as constructed,the experim ental results provided the basis of industrial p roduction Key words: thym opentin; purification; identification 胸腺五肽 (thym opentin,TP5)是促胸腺生成素32~36上5个氨基酸组成的小肽,基本序列为NH, A rgLysA sp-Val-TyrCOOH,它保留了胸腺生成素的有效生物性。TP5是一种免疫调节剂,对机体免疫功能具有双向调节作用11-21,在临床上主要用于原发性和继发性免疫缺陷症,并用作各种恶性肿瘤前期化疗、放疗的辅助用药,是目前治疗艾滋病的最有疗效和潜力的胸腺激素之 一33]。在国外,固相合成多肽已作为合成多肽的主要方法41应用于合成30肽以下的小肽;在国内,天津大学5-6]中国科学院上海生命研究院、南京京业大学131等已经开始从事固相多肽合成的研究,但对于固相合成胸腺五肽的分离纯化工工报道较少。本文采用 Sephadex G-25凝胶柱结合制备型高效液相色谱仪分离纯化粗肽产物,并建立了高效、简便的分析鉴定方法。 ( 收稿日期:2008-10-30 ) ( 基金项目:沈阳市大型仪器设备共享服务专项(2007GX-27) ) ( 作者简介:潘岳峰(1982-),女汉族),吉林通化人,硕士研究生, Tel: (024) 23986442, Email panyuefeng521@163. com; 韩静(1967-),女(蒙古族),辽宁沈阳人,副教授,博士,从事原料药合成纯化工艺的研究, Tel: 13624078768,Email: hj-8080@163. com ) 1仪器与试药 1.11仪器 循环制备液相色谱仪(JAI,LC-9103型);冷冻干燥机 (EYECA, FDU-1100);旋转蒸发仪(RE-52,上海亚荣生化仪器厂); SHZ-D (Ⅲ)型循环水式真空泵巩义市予华仪器有限公司);电子天平 (ALC-210.3,北京赛多利斯仪器系统有限公司);800B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);DZF-1型真空干燥箱(北京市光明医疗仪器厂);高效液相色谱仪(日本日立公司);质谱仪 (B rukerM icrotofQ)。 1.2试药 Sephadex G-25凝胶柱 (50mm ×100 mm,浙江黄岩四青升华材料厂);N,N二甲基甲酰胺(DMF);哌啶;体积分数 20%哌啶 /DMF混合溶液(DBLK);一氧-3双二甲胺羰基苯并三氮唑四氟化硼盐(TBTU);茚三酮;二异丙基乙基胺(D IPEA );异丙醇;三氟醋酸(TFA,购自 M erck公司);硫代苯甲醚;1,2乙二硫醇;苯甲醚;冰乙酸;无水乙醚;乙腈(ACN);醋酸胺;1,2二羟基苯并三氮唑 (HOBT,99%);N,N不环己基碳二甲胺(DCC,99%); Wang树脂。 2方法与结果 2.1粗肽制备 将 13.870 g的 FmocL-Tyr (Bu)O W angResin倒入 250 mL 合成柱中,加入DMF溶胀3 h。加入DBLK溶液,氮气保护下反应30m in。抽去DBLK溶液, DMF多次洗涤。用 0.5 mokLTB TU-HOBT液(加入与氨基酸等摩尔的体积)与1.0molLD IPEA 液(3倍于氨基酸摩尔数的体积)溶解后,加入至反应柱中,开始反应,以茚三酮检测阴性为反应终点。反应完毕后抽去氨基酸偶联液,洗涤树脂,以 DMF洗涤6次,以异丙醇洗涤3次。将氨基酸(氨基酸投料量见表1)按照顺序去保护偶联洗涤循环操作。合成完毕后,洗涤树脂,真空干燥,得肽树脂 23.674 g。 Table 1 The quantities of AA AA Grammolecule/mmol m/g Fmoc-ValOH 26.26 8.913 Fmoc-A sp(O Bu) OH 26.26 10.805 FmocLys(Boc)OH 26.26 12.302 Fmoc-A rg(Pbf)-OH 35.01 22.709 2.22粗肽后处理 将配制好的裂解液(TFA 硫代苯甲醚-1,2乙二硫醇苯甲醚,体积比积20512.57.94.6)加入装有肽树脂的圆底烧瓶中,充氮3min后,避光搅拌反应3h。再经砂芯过滤,适量 TFA洗涤树脂。滤液加入冰冻的无水乙水中,密封,陈化3 h。离心收集沉淀,适量冰冻无水乙醚洗涤。沉淀以体积分数30%冰乙酸水混合溶液溶解,分装成五瓶,置低温冰箱冷冻,凝固后置冻干机中冻干。得粗肽 5.910g(含盐),理论值为0.6798×8.739mmol=5.941 g.收率:(5.910 g/5.941 g)100%=99.48% 2.3粗肽脱盐 用0.08 mol LNHAc (pH 3.0)溶液平衡Sephadex G-25(50 mm ×100 mm)凝胶柱,取胸腺五肽粗品 5.910 g,溶解在 100 mL NHAc溶液(pH 3.0)中,用 0.45m微孔滤膜过滤,将滤液上样,以 NHAc溶液洗脱,在275nm监测,上样量2.00 g次,流速为 5mLmin ,收集有吸收的组分。将收集的精制液减压蒸馏,控制质量浓度在100mg mL左右时冷冻干燥。得到脱盐肽5.544 g。收率:(5.544 g/5.910 g)×100%=93.8% 2.4循环制备液相纯化 纯化条件:上样量:250mg次,共纯化5.544 g;流动相 A: HO +0.1% TFA;流动相 B:ACN + 0.1%TFA;流动相 C: 80 mol LNHAc(pH5.0) + 6.0%ACN;流动相 D: 80 mmol LNHAc(pH 5.0);梯度:100%B清洗柱子;100%A平衡柱子;100%D平衡基线;100%C洗脱样品。色谱柱: Vydac-90 A-C18反相柱(2.2mm×250 mm);检测波长:275 mm;流速:9mL min 。纯化过程:取脱盐肽5.544 g,加注射用水溶解稀释至50mg mL,用0.45m微孔滤膜过滤,滤液上制备型高效液相色谱仪,每次进微滤液3mL,分段收集主要吸收峰的流出液,随时用高效液相色谱仪检测,以确保质量合格。收集精制 液,减压浓缩至20mL。 2.5;精肽脱盐 将精制胸腺五肽的浓缩液20mL分次加样于 Sephadex G-25凝胶柱(50mm ×100 mm)上,上样量5mL次,流速5mL· min-1,以无热源水洗脱。在275mm监测,收集有吸收组分。将收集 的精制液减压蒸馏,浓缩至小体积,控制浓度在100 mg mL左右时冷冻干燥。得产物4.905 g,收率:(4.905 g/5.544 g)×100%=88.48% 2.6质谱鉴定分子质量 质谱条件:电喷雾源(ESIS源);正离子扫描模式;气帘气(CUR)为 5.8 psi;电喷雾电压(IS)为4500V;温度190℃. 鉴定方法:将TP5用适量甲醇溶解,采用文 献[9]的直接进样分析方式将样品直接注入质谱仪。 TP5主成分的质谱分析结果如图1所示。图中可观察到主成分的分子离子峰,其中 m/z680.3726为目标肽的单电荷质谱峰。结果表明,其相对分子质量与图2所示的理论相对分子质量基本一致,可以确定主成分的氨基酸序列为 NH-ArgLys-A sp-Val-Tyr-COOH,即目标五肽。 Figure 1 Mass spectrum analysis of TP5 C, 53.01; H, 7.27; N,18.54;O, 21.18 Figure 2 Molecular structure of TP5 精密称取胸腺五肽对照品 5 mg,加入适量甲醇,定容至25mL。精密吸1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL标准品溶液分别置于25 mL容量瓶中,用甲酒定容至刻度。0.45u m滤膜过滤,依次进样20pL,按上述色谱条件测定峰面积值。在8~40ugmL 范围内浓度(c)与峰面积(A)呈良好线性关系:A=6E+08c- 453306 (r=0.999 9)。 分别对仪器精密度和样品准确度进行了测试,结果显示 RSD值均小于 2.0%。 2.8HPLC色谱鉴定纯度 色谱条件:色谱柱:Diamonsil TM C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5u m,迪马公司);流动相:磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7)甲醇(体积比 6040);柱温:30℃;流速:1.0mL; min;紫外检测波长:275nm;进样量:20uL。 色谱行为:分别取粗肽脱盐和精肽脱盐后的干燥产品1 mg,用流动相定容于 50mL容量瓶中,进样20uL,得到如图3及图4所示的色谱图。 Figure 3 Aaalysis of crude TP5 by HPL C Figure 4 Aaalysis of pure TP5 by HPLC 可见,主峰和杂质峰分离良好,经盾环制备液相分离后,主峰含量有显著提高,由标准曲线方程得到粗肽脱盐后和精肽脱盐后的纯度分别为89.61%、99.02%。 3讨论 本文对固相合成胸腺五肽的工艺条件进行了改进,筛选出最佳反应溶剂、宿合剂和树脂切割剂。该工艺条件温和,操作简单,减少了副产物的生成,且收率较文献[10]所报道的提高了约10%。 根据多肽粗品的来源、对纯度的要求和活性的保持等,选择合适的纯化方案是关键的一步。本文使用循环制备液相色谱将杂质和主药有效分离,建立了简单有效的纯化方法。经3次循环分离后产品纯度达到]99%以上,为多肽的纯化提供了较好的依据。 多肽的分子质量是多肽识别与鉴定中首先需要测定的参数。对于合成多肽纯度较高的可直接进行 ESHS测定。 ES测定 75 000Da分子质量以内的化合物其准确度可达5×10,这远比其它方法(如 SDS-PAGE凝胶过滤,超离心等)精确得多。用质谱法测定具有快速、准确、样品消耗量少的特点,是目前灵敏度最高的分析方法。由于 ESI电离源产生的是多电荷,拓宽了质谱的测量范围。 ( 参考文献: ) ( [1] GON SER S , WEBER E , FOLKER S Pe p tides and polypep tides as modulators o f t he i nmune re s ponse: thymopentin-an examp le with unknown mode of action[J]. 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