粗肽中胸腺五肽检测方案

第 19卷第2期2009年4月总88期中国药物化学杂志Chinese Journal of M edic inal Chem istryVol. 19 No.2 p. 126Apr.2009 Sum 88 第2期潘岳峰等：固相合成胸腺五肽的分离纯化与鉴定 固相合成胸腺五肽的分离纯化与鉴定 潘岳峰，韩静，张立军军，殷莉梅，张玥' (1.沈阳药科大学制药工程学院，辽宁沈阳110016； 2吉林敖东延边药业股份有限公司检测中心，吉林延边133700) 摘要：目的建立胸腺五肽分离纯化、分析鉴定方法，有效提高胸腺五肽含量。方法将标准 Fmoc方法固相合成的胸腺五肽以 Sephadex G-25凝胶柱使粗肽脱盐，以循环制备液相色谱仪进行粗肽纯化，以质谱法进行分子质量的鉴定。结果该法得到胸腺五肽的纯度为99.02%，分质质量测定值与理论值相符。结论建立了高效、简便的胸腺五肽分离纯化方法，为工业化生产提供了实验依据。 关键词：胸腺五肽；纯化；鉴定 中图分类号：R978.1 文献标志码：A Separation， pur ifica tion and iden tifica tion ofsolid pha se syn thesis thym open tin PANYue-feng， HAN Jing， ZHANG Lijun，YN Limei，ZHANG Yue (1. School of Phamaceutical Engineering， Shenyang Pha maceuticalU niversity， Shenyang 110016，China；2. The Center of D etection， Jilin Aodong Yanbian Phammaceutical Industry Co.， L td， Yanbian 133700， China) Abstract：A in To construct the m ethod of separation， purifying and identifying m ethod of thym opentin， andto elevate effectually thym opentin content M ethods The thym opentin synthesized by solid phasestrategy， w asdesalted by Sephadex G-25， purified by recycling preparative HPL C， and identified by mass spectrum. Re-sults The purity of synthesized thym opentin was 99.02% and the molecularw eightm atched w ith theoretical-values Conclusion The highperfomm ance and convenientmethod of purifying thym opentin w as constructed，the experim ental results provided the basis of industrial p roduction Key words： thym opentin； purification； identification 胸腺五肽 (thym opentin，TP5)是促胸腺生成素32~36上5个氨基酸组成的小肽，基本序列为NH， A rgLysA sp-Val-TyrCOOH，它保留了胸腺生成素的有效生物性。TP5是一种免疫调节剂，对机体免疫功能具有双向调节作用11-21，在临床上主要用于原发性和继发性免疫缺陷症，并用作各种恶性肿瘤前期化疗、放疗的辅助用药，是目前治疗艾滋病的最有疗效和潜力的胸腺激素之 一33]。在国外，固相合成多肽已作为合成多肽的主要方法41应用于合成30肽以下的小肽；在国内，天津大学5-6]中国科学院上海生命研究院、南京京业大学131等已经开始从事固相多肽合成的研究，但对于固相合成胸腺五肽的分离纯化工工报道较少。本文采用 Sephadex G-25凝胶柱结合制备型高效液相色谱仪分离纯化粗肽产物，并建立了高效、简便的分析鉴定方法。 ( 收稿日期：2008-10-30 ) ( 基金项目：沈阳市大型仪器设备共享服务专项(2007GX-27) ) ( 作者简介：潘岳峰(1982-)，女汉族)，吉林通化人，硕士研究生， Tel： (024) 23986442， Email panyuefeng521@163. com； 韩静(1967-)，女(蒙古族)，辽宁沈阳人，副教授，博士，从事原料药合成纯化工艺的研究， Tel： 13624078768，Email： hj-8080@163. com ) 1仪器与试药 1.11仪器 循环制备液相色谱仪(JAI，LC-9103型)；冷冻干燥机 (EYECA， FDU-1100)；旋转蒸发仪(RE-52，上海亚荣生化仪器厂)； SHZ-D (Ⅲ)型循环水式真空泵巩义市予华仪器有限公司)；电子天平 (ALC-210.3，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；800B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；DZF-1型真空干燥箱(北京市光明医疗仪器厂)；高效液相色谱仪(日本日立公司)；质谱仪 (B rukerM icrotofQ)。 1.2试药 Sephadex G-25凝胶柱 (50mm ×100 mm，浙江黄岩四青升华材料厂)；N，N二甲基甲酰胺(DMF)；哌啶；体积分数 20%哌啶 /DMF混合溶液(DBLK)；一氧-3双二甲胺羰基苯并三氮唑四氟化硼盐(TBTU)；茚三酮；二异丙基乙基胺(D IPEA )；异丙醇；三氟醋酸(TFA，购自 M erck公司)；硫代苯甲醚；1，2乙二硫醇；苯甲醚；冰乙酸；无水乙醚；乙腈(ACN)；醋酸胺；1，2二羟基苯并三氮唑 (HOBT，99%)；N，N不环己基碳二甲胺(DCC，99%)； Wang树脂。 2方法与结果 2.1粗肽制备 将 13.870 g的 FmocL-Tyr (Bu)O W angResin倒入 250 mL 合成柱中，加入DMF溶胀3 h。加入DBLK溶液，氮气保护下反应30m in。抽去DBLK溶液， DMF多次洗涤。用 0.5 mokLTB TU-HOBT液(加入与氨基酸等摩尔的体积)与1.0molLD IPEA 液(3倍于氨基酸摩尔数的体积)溶解后，加入至反应柱中，开始反应，以茚三酮检测阴性为反应终点。反应完毕后抽去氨基酸偶联液，洗涤树脂，以 DMF洗涤6次，以异丙醇洗涤3次。将氨基酸(氨基酸投料量见表1)按照顺序去保护偶联洗涤循环操作。合成完毕后，洗涤树脂，真空干燥，得肽树脂 23.674 g。 Table 1 The quantities of AA AA Grammolecule/mmol m/g Fmoc-ValOH 26.26 8.913 Fmoc-A sp(O Bu) OH 26.26 10.805 FmocLys(Boc)OH 26.26 12.302 Fmoc-A rg(Pbf)-OH 35.01 22.709 2.22粗肽后处理 将配制好的裂解液(TFA 硫代苯甲醚-1，2乙二硫醇苯甲醚，体积比积20512.57.94.6)加入装有肽树脂的圆底烧瓶中，充氮3min后，避光搅拌反应3h。再经砂芯过滤，适量 TFA洗涤树脂。滤液加入冰冻的无水乙水中，密封，陈化3 h。离心收集沉淀，适量冰冻无水乙醚洗涤。沉淀以体积分数30%冰乙酸水混合溶液溶解，分装成五瓶，置低温冰箱冷冻，凝固后置冻干机中冻干。得粗肽 5.910g(含盐)，理论值为0.6798×8.739mmol=5.941 g.收率：(5.910 g/5.941 g)100%=99.48% 2.3粗肽脱盐 用0.08 mol LNHAc (pH 3.0)溶液平衡Sephadex G-25(50 mm ×100 mm)凝胶柱，取胸腺五肽粗品 5.910 g，溶解在 100 mL NHAc溶液(pH 3.0)中，用 0.45m微孔滤膜过滤，将滤液上样，以 NHAc溶液洗脱，在275nm监测，上样量2.00 g次，流速为 5mLmin ，收集有吸收的组分。将收集的精制液减压蒸馏，控制质量浓度在100mg mL左右时冷冻干燥。得到脱盐肽5.544 g。收率：(5.544 g/5.910 g)×100%=93.8% 2.4循环制备液相纯化 纯化条件：上样量：250mg次，共纯化5.544 g；流动相 A： HO +0.1% TFA；流动相 B：ACN + 0.1%TFA；流动相 C： 80 mol LNHAc(pH5.0) + 6.0%ACN；流动相 D： 80 mmol LNHAc(pH 5.0)；梯度：100%B清洗柱子；100%A平衡柱子；100%D平衡基线；100%C洗脱样品。色谱柱： Vydac-90 A-C18反相柱(2.2mm×250 mm)；检测波长：275 mm；流速：9mL min 。纯化过程：取脱盐肽5.544 g，加注射用水溶解稀释至50mg mL，用0.45m微孔滤膜过滤，滤液上制备型高效液相色谱仪，每次进微滤液3mL，分段收集主要吸收峰的流出液，随时用高效液相色谱仪检测，以确保质量合格。收集精制 液，减压浓缩至20mL。 2.5；精肽脱盐 将精制胸腺五肽的浓缩液20mL分次加样于 Sephadex G-25凝胶柱(50mm ×100 mm)上，上样量5mL次，流速5mL· min-1，以无热源水洗脱。在275mm监测，收集有吸收组分。将收集 的精制液减压蒸馏，浓缩至小体积，控制浓度在100 mg mL左右时冷冻干燥。得产物4.905 g，收率：(4.905 g/5.544 g)×100%=88.48% 2.6质谱鉴定分子质量 质谱条件：电喷雾源(ESIS源)；正离子扫描模式；气帘气(CUR)为 5.8 psi；电喷雾电压(IS)为4500V；温度190℃. 鉴定方法：将TP5用适量甲醇溶解，采用文 献[9]的直接进样分析方式将样品直接注入质谱仪。 TP5主成分的质谱分析结果如图1所示。图中可观察到主成分的分子离子峰，其中 m/z680.3726为目标肽的单电荷质谱峰。结果表明，其相对分子质量与图2所示的理论相对分子质量基本一致，可以确定主成分的氨基酸序列为 NH-ArgLys-A sp-Val-Tyr-COOH，即目标五肽。 Figure 1 Mass spectrum analysis of TP5 C， 53.01； H， 7.27； N，18.54；O， 21.18 Figure 2 Molecular structure of TP5 精密称取胸腺五肽对照品 5 mg，加入适量甲醇，定容至25mL。精密吸1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL标准品溶液分别置于25 mL容量瓶中，用甲酒定容至刻度。0.45u m滤膜过滤，依次进样20pL，按上述色谱条件测定峰面积值。在8~40ugmL 范围内浓度(c)与峰面积(A)呈良好线性关系：A=6E+08c- 453306 (r=0.999 9)。 分别对仪器精密度和样品准确度进行了测试，结果显示 RSD值均小于 2.0%。 2.8HPLC色谱鉴定纯度 色谱条件：色谱柱：Diamonsil TM C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5u m，迪马公司)；流动相：磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7)甲醇(体积比 6040)；柱温：30℃；流速：1.0mL； min；紫外检测波长：275nm；进样量：20uL。 色谱行为：分别取粗肽脱盐和精肽脱盐后的干燥产品1 mg，用流动相定容于 50mL容量瓶中，进样20uL，得到如图3及图4所示的色谱图。 Figure 3 Aaalysis of crude TP5 by HPL C Figure 4 Aaalysis of pure TP5 by HPLC 可见，主峰和杂质峰分离良好，经盾环制备液相分离后，主峰含量有显著提高，由标准曲线方程得到粗肽脱盐后和精肽脱盐后的纯度分别为89.61%、99.02%。 3讨论 本文对固相合成胸腺五肽的工艺条件进行了改进，筛选出最佳反应溶剂、宿合剂和树脂切割剂。该工艺条件温和，操作简单，减少了副产物的生成，且收率较文献[10]所报道的提高了约10%。 根据多肽粗品的来源、对纯度的要求和活性的保持等，选择合适的纯化方案是关键的一步。本文使用循环制备液相色谱将杂质和主药有效分离，建立了简单有效的纯化方法。经3次循环分离后产品纯度达到]99%以上，为多肽的纯化提供了较好的依据。 多肽的分子质量是多肽识别与鉴定中首先需要测定的参数。对于合成多肽纯度较高的可直接进行 ESHS测定。 ES测定 75 000Da分子质量以内的化合物其准确度可达5×10，这远比其它方法(如 SDS-PAGE凝胶过滤，超离心等)精确得多。用质谱法测定具有快速、准确、样品消耗量少的特点，是目前灵敏度最高的分析方法。由于 ESI电离源产生的是多电荷，拓宽了质谱的测量范围。 ( 参考文献： ) ( [1] GON SER S ， WEBER E ， FOLKER S Pe p tides and polypep tides as modulators o f t he i nmune re s ponse： thymopentin-an examp le with unknown mode of action[J]. 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