瓜蒌薤白白酒汤活性成分中黄酮类活性成分检测方案

中国中药杂志China Journal of Chinese Materia MedicaVol.28 ，Issue.5May 2003第28卷第5期2003年5月 瓜蒌薤白白酒汤活性成分研究(Ⅲ)黄酮类活性成分 何祥久，王乃利，邱 峰，姚新生 (沈阳药科大学中药学院天然药化教研室，辽宁沈阳110016) [摘要]目的：研究瓜蒌薤白白酒汤药效作用的物质基础。方法：在药理活性指导下利用各种化学和色谱手段对复方进行追踪分离利用化学及波谱手段鉴定化学结构。结果：从活性部位中分离得到4个黄酮类化合物。结论：化合物1~3为首次从组成该复方单味中药中首次分离得到。化合物1具有较好的抑制血小板聚集活性。 [关键词]瓜蒌薤白白酒汤活性成分黄酮类化合物抗血小板聚集 [中图分类号]R284.1[文献标识码]A[[文章编号]1001-5302(2003)05-0420-04 瓜蒌薤白白酒汤是汉代名医张仲景的著名方剂，出自《金匮要略》，由瓜蒌、薤白和白酒等3味中药组成具有通阳散结、行气驱痰之功效。现代临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛等疗效显著1。国内外，人们对其研究主要局限于临床和药理活性研究的报道，而对其基础研究特别是此复方发挥作用的物质基础研究尚未见报道。鉴于上述研究现状， 计划用我们研究中药复方的思路2.3]，对瓜蒌薤白白酒汤的活性成分进行研究，以期能究明其发挥作用的物质基础及组方依据。 在活性指导下我们对此复方进行了系统分离。我们从此复方的活性部位中分离鉴定了4个黄酮类化合物，通过化学及波谱学手段，鉴定了其结构，图1为化合物1~4的化学结构。 R-O 图1化合物1~4的化学结构 熔点在 Yanaco 显微熔点测定仪上测定(未校正)， NMR在500 MHz核磁共振仪上测定，IR 在Bruker 红外测定仪上测定。 FAB-MS 在VG Au-tospec 300质谱仪上测定。柱层析和薄层层析用硅胶(青岛海洋化工厂)，ODS ，Sephadex( Pharmacia 公司)预制硅胶板( Merck 公司)。显色剂为10%硫酸-乙醇溶液。 MG-196 型血小板聚集仪(上海医科大学博高实业有限公司)。 ( [收稿日期] 2 2002-08-05 ) ( [基金项目]目国家医药监督管理局新药基金(93-44-N-22) ) ( [通讯作者] 姚新生 Tel：(024 )23993994 Fax ：( 024 ) 23993994 E -mail ： yaoxinsheng @hotmail. com. ) ( 420万方数据 ) 制备型 HPLC 为 LC-10( 日本分析工业朱式会社)，示差检测器。色谱柱为 Econosphere Ci8( 22mmx 250 mm，Alltech，USA )，流动相为 MeOH-H0流速8mL min-1。 HPLC 用溶剂为色谱纯，其余溶剂为分析纯. 中药瓜蒌和薤白购自辽宁省药材站，由沈阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定为Trichosantheskirilowii Max.和 Allium macrostemon Bge.. 2 提取和分离 瓜蒌15 kg 和薤白 10 kg混合，用10倍量的60%乙醇回流提取3次合并60%乙醇提取液减压回收溶剂得提取物浸膏。浸膏用水溶解后，依次用等体积的乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取3次，得乙酸 乙酯层、正丁醇层和水层等3部分经抗血小板聚集活性测试表明，正丁醇层抗血小板聚集活性最强，因此对正丁醇层作了进一步分离。正丁醇层448g上D101大空吸附树脂，水-乙醇梯度洗先，得水，10%，30%50%和乙醇洗脱等5部分其中10%30%和乙醇洗脱等3部分活性较好，但以30%乙醇洗脱部分性最强，所以对此部分进一步分离。30%乙醇洗脱部分(50.34g)再经硅胶柱层析， Diaion HP-20，ODS 及 Rp 18 HPLC，分离得到化合物1~4. 3结构鉴定 化合物1 白色粉末，熔点272~273℃，盐酸-镁粉及 Molish 反应均为阳性，酸水解检出葡萄糖和鼠李糖，提示该化合物为黄酮苷类化合物。FAB-MS(+)显示分子量为610[M+]，结合lH-NMR及13C-NMR可推知其分子式为 C28H34015。 IR中显示出多羟基吸收峰(3472cm-1)共轭羰基(1647 cm-1)及苯环的吸收峰(1607 ，1524cm-1)。 表1 化合物1的炭氢核磁共振信号归属 注：①""表示为信号重叠(表2同)②所有核磁图谱在气代吡 H-NMR及COSY谱中，在最低场处有有 ABX自旋偶合系统的3组峰，分别为87.51(H，d，J=1.9 Hz)7.11(H ，dd ，J=8.3 ，1.9 Hz )和6.97(H，dJ=8.3Hz)，为黄酮类化合物B环上3个质子信号。在86.49，6.60处的氢相互偶合，偶合常数为2.1Hz 是A环间偶质子的信号。812.48处的氢为活泼氢信号，是黄酮类化合物5位羟基的特征信号。810.50有另一羟基活泼氢信号，在85.62(d，J=7.4 Hz)和5.49( overlapped)处为2个糖端基质子信号。13C-NMR中，8197.1为二氢黄酮羰基碳的特征吸收信号，结合 HMQC 谱及 HMBC谱，8101.5和102.5为2个糖的端基碳信号。在 HMBC谱中，葡萄糖端基氢(85.62)与 C-7(8166.5)处的碳相关说明葡糖糖连接在C-7位。从 DEPT看出，葡萄糖6位(=CH，)向低场发生了较大的位立(+5.0)，而且在 HMBC谱中，鼠李糖端基氢与葡萄糖6位碳有相关峰，说明鼠李糖连接在葡萄糖的6位。CH，0-信信号与8148.4位碳相关。综上分析，并结合文献[4]化合物1鉴定为3'5-二羟基-4'-甲氧基黄酮7-0--L-鼠李糖基(1→6)B-D-葡萄糖苷。该化合物是从组成该复方单味药中首次分离得到。 化合物2为白色无定型粉末熔点254~255℃盐酸-镁粉及 Molish 反应均为阳性，酸水解检出葡萄糖和鼠李糖，提示该化合物为黄酮苷类化合物。在碳谱中显示28个碳信号，结合氢谱，可推测该化合物的分子式为C28H34015. 化合物2与1在H-NMR 及 COSY 谱十分相似在最低场处亦有一 ABX系统的3组峰，为黄酮类化合物B环上3个氢信号。85.50(H，dd，J=12.2 3.0Hz 立2位氢信号，从偶合常数可知2位为s构型。83.76(3H，s)为甲氧基信号，最高场81.15(3H，d，J=6. 1Hz )为鼠李糖上甲基信号。在HMBC谱中，鼠李糖端基氢(85.08)与黄酮母核7位(8164.9)相关，说明鼠李糖连接在黄酮的7位。葡萄糖端基氢(85.10)与鼠李糖2位相关，且鼠李糖2位碳向低场位移了+5.0，鼠李糖的3位向高场位移了-1.0说明葡萄糖连接在鼠李糖的2位。综合DEPT ，HMQC ，HMBC 及文献[5，6]，可推定此化合物为3'5-二羟基-4'-甲氧基黄酮7-0-3-D-葡萄糖基(1→2)a-L-鼠李糖苷。该化合物是从组成该复方单味药中首次分离得到。 表2化合物2的炭氢核磁共振信号归属 注：所有核磁图谱在DMSO-d6 500 MHz核磁辰振波谱仪上测定 化合物3 淡黄色无定型粉末，熔点200~201℃盐酸-镁粉及 Molish 反应均为阳性，酸水解检出葡萄糖和鼠李糖，提示该化合物为黄酮苷类化合物。FAB-MS( pos )显示分子量为580，结合该化合物碳谱和氢谱，可推测该化合物的分子式为 C27H32014. 化合物3的A环氢信号与化合物1非常相似，在B环上质子信号差别较大，化合物3为ABz自旋偶合系统。在812.50和11.75处有2个羟基上活泼氢信号其中812.50为5位羟基氢的特征吸收信号，由此可推知此化合物为3'，5-二羟基-7-氧黄酮苷类化合物经酸水解检出了葡萄糖和鼠李糖。经与文献[7]对照将此化合物确定为4'5-二羟基黄酮-7-0-a-L-鼠李糖基(1→2)3-D-葡萄糖苷。 化合物4淡黄色粉末，盐酸-镁粉反应阳性，Molish 反应阴性，提示该化合物为黄酮类化合物。通过与已知化合物皮素共薄层，在3种不同系统条件下Rf值均一致，因此化合物4被鉴定为皮素，(quercetin )。 4 抗血小板聚集活性 我们测试了所分离得到的黄酮对体外二磷酸腺苷、血小板活化因子及凝血酶等诱导的大鼠血小板聚集的影响。化合物1~3均具有抑制 ADP 及 PAF诱导的血小板聚集活性其中化合物1的活性最强。 ( [参考文献] ) ( [1] 许沛源.方剂学.北京：人民卫生出版社 ，1995.371. ) ( [2 ] 何祥久邱峰姚新生.中药复方研究现状和思路.化学进展， 2001 ， 13(6)481. ) ( [3] 姚新生胡 柯.中药复方研究思路.化学进展，1999 ，11(2)： 192. ) ( [4] Wagner H， Chari VM. Carbon-13NMR Sp e ctra of Nature Fla- vanoids . T etrahedron L e tt ， 1 9 76 ： 1 799. ) ( [5] ] Duddeck H ， Snatzke G， Y emul SS. 1 3 C NMR of F lavanoids fr o m Garcinia Species and of Re lated F l avonones.l P hytochemistry 1 978 ，17 ：1369. ) ( [6] M Markharm K R ，Ternai B. 1 3 C NMR of Fla v anoids-II，Flavanoids Other Then F l avone and Fl a vonol Ag l y cone. Tet r ahedron ， 1976 ， 32(21 ) ：2607. ) ( [7] 于德泉杨峻山.分析化学手册-核磁共振波谱分析.北京：化学 工业出版社，1999.822. ) Research on Active Constituents Research of Gualou xiebai baijiutang(Ⅲ )the Active Flavanoids HE Xiang-jiu， WANG Nai-li， QIU Feng，YAO Xin-sheng ( School of Traditional Chinese Materia Medica ， Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016， Liaoning ， China) [Abstract] Objective： To observe the substance basis of actions of Gualou xiebai baijiutang. Method ： Guided by bioactivi-ties ， the prescription was isolated and purified by chemical and chromatographic methods ，and the structures were identified by chem-4422万方数据 ical and spectral methods. Result：4 compounds were isolated from active parts. Conclusion ： 3 compounds were isolated for the firsttime from Trichosanthes kirilowii and Allium macrostemon. Compound 1 had a good activity against platelet aggregation. [Key words](Gualou xiebai baijiutang ； active constituents ； flavanoids ；anti-platelet aggregation ( [责任编辑 李 禾 ) 当归中苯内酯类化合物的分离与结构鉴定 路新华2，梁鸿，赵玉英 (1.北京大学药学院天然药物学系北京100083； 2.华北制药集团新药开发中心河北石家庄050015) [摘要]目的：研究当归药理活性的物质基础。方法：首先用色谱法分离化学成分，用波谱法鉴定其结构。结果：从岷当归根乙醇提取物中分离到5个化合物经光谱分析分别鉴定为(Z)苯内酯(Z)6，7-环氧苯内酯，(Z)6，7-反式-二羟基苯内酯(E)6，7-反式-二羟基莫苯内酯和当归酸(Z)酸苯内酯-11-醇酯(11-an-geloylsenkyunolide F)。结论：当归酸(Z)苯内酯-11-醇酯为首次从当归获得。 [关键词]当归蔔苯内酯；当归酸(Z)苯内酯-11-醇酯 [中图分类号]R284.1[文献标识码]A[文章编号]1001-5302(2003)05-0423-03 当归 Angelica sinensis ( Oliv.) Diels 是伞形科当归属一种多年生草本植物，其干燥的根是我国一味常用中药材，药用历史悠久，历代本草均有记载，有补血和血调经止痛润肠滑肠之功效11。《中国药典》2000年版版收载的复方中有79个含有当归。当归成分非常复杂，为了解当归药理作用的物质基础我们首先对当归化学成分进行了系统研究。本文报道从当归根的乙醇提取物中用色谱方法分离到5个化合物，经波谱法鉴定其结构均为藁苯内酯类 化合物，分别为(Z)苯内酯[(Z )ligustilide ，1]，(Z)6，7-环氧苯内酯[(Z )-6 ，7-epoxyligustilide，2](Z)6，7-反式-二羟基法苯内酯[(Z)6 ，7-tran-dihydroxyligustilide ，senkyunolide I ，3 ](E)-6，7-反式二二基羟苯内酯[(E)6，7-tran-dihydrox-yligustilide 4]和当归酸(Z)本内酯-11-醇酯( 11-当归归基-Z-11-羟基本内酯)[11-an-geloylsenkyunolide F，5]。化合物5为首次从该植物中分离得到。 图1化合物1~5的化学结构 1.(Z)苯内酯 2.(Z)67-环氧苯内酯3.(Z)67-反式-二羟基苯内酯4.(E)6，7-反式-二羟基苯内酯 5.当归酸(Z)苯内酯-11-醇酯 1 药材仪器和试剂 [收稿日期]22003-01-15[通讯作者] 赵玉英 Tel ：(010)62091592 Fax：(010) 当归A. sinensis 于2002年3月购自北京，由北京大学药学院天然药物系郑俊华教授鉴定。 E-mail nmechem@bjmu.edu.cn方数据