低聚糖、冬虫夏草 、皂角苷等样品中主要成分含量检测方案(制备液相色谱)

循环制备HPLC案例：天然药物的分离制备 高分子分析D未来七取組! JN日本分析工業株式会社 网址： http：//www.jai.co.jp 北京佳仪分析设备有限公司(JAI-CHINA) URL： http：//www.xiantong.com.cn http：//www.jai.com.cn Email： sales@xiantong.com.cn TEL： 010-64839771/72 FAX： 010-64839761 地址： 北京市朝阳区大屯路甲3号中科院理化所合作实验室(100101) 日本分析工业株式会社简介 日本分析工业株式会社(JAI， Japan Analytical Industry Co.， Ltd.)成立于 1965年。30年来，秉承“开发全球独有的分析仪器”的企业理念， JAI开发出一系列独具特色的分析仪器，在全球专业仪器设备领域占据着十分重要的地位。 我们的主要产品有： 循环制备液相色谱 (Recycling Preparative HPLC) 居里点热裂解仪 (Curie Point Pyrolyzer for GC) 吹扫捕集采样-热解吸仪 (Purge & Trap Sampler/Thermal Desorption) 冷冻粉碎机 (Cryogenic Sample Crusher) 指纹鉴定仪 (Laser Fingerprint Detector) JAI 的液相色谱仪真正实现了循环制备功能，是很多著名科学家制备液相色谱仪的首选，备受推崇。此外，将 Pyrofoil技术应用于热裂解分析是 JAI的首创，它已成为居里点裂解仪的全球标准。 我们的仪器广泛应用于石油、化工、制药、电子、公安鉴证等领域，极大地推动了世界科学技术的发展。我们将恪守不断创新、追求卓越的宗旨，以一贯领先的专业水准、严谨细致的售后工作为您竭诚服务! 北京佳仪分析设备有限责任公司(JAI-China Co.，Ltd.)是日本分析工业株式会社在中国的分支机构，全权负责日本分析工业株式会社所有产品在中国的技术咨询、销售、维修等业务。 请您根据以下的联系方式与我们联系： TEL： 010-64839771/72 FAX： 010-64839761 Email：sales@xiantong. com. cn URL： http：//www.xiantong.com.cn http：//www.jai.com.cn(建站中，敬请期待) 地址： 北京市朝阳区区屯路甲3号中科院理化所合作实验室(100101) 目录 1.普通制备型HPLC与JAI循环制备HPLC的区别 2.循环制备 HPLC 的分析案例 2 1)低聚糖 KFA溶液 2 2)低聚糖A 3 3) Ecdysteroid 系试样 4 4)冬虫夏草 5 5)一般天然物(生理活性物质) 6 6)Saponin 皂角苷(药用人参提取物) 7 7)西伯利亚产药用人参 (Araliaceae 果)1 9 8)西伯利亚产药用人参(Araliaceae 果)2 10 9)Ethaboxam 11 10)Taxol 12 11)淫羊藿 13 12) Tagatose(塔格糖)， Galactose(半乳糖)的低聚物 14 1.普通制备型HPLC 与 JAI 循环制备HPLC的区别 表1.普通制备型 HPLC 与 JAI循环制备 HPLC 的比较 项目 普通制备 HPLC JAI循环制备 HPLC 循环次数 以梯度洗脱提高分离效果为 采用循环方式提高分离效果，循环次数不限 主，仅可循环一次 溶剂消耗量 100~300mL/min 3~5mL/min 色谱柱寿命 2-3年 6-10年 理论塔板数 一般为7000 一般为15000 检测器使用情况 单独使用 UV 或 RI检测器 同时使用 UV 或 RI检测器 检测器的检测范围 仅用于样品制备 制备和分析时均可使用 重复进样和自动循环 可装配自动进样器 两者均可装配 1)使用 JAI 独创的循环技术，通过将目标化合物在同一一色谱柱内反复循环，直至使其完全分离和制备，相当于将试样注入更长色谱柱内的分离效果。其他公司的仪器由于在循环中检测池破损 (JAI 采用独特的检测池配置，不会因为压力变化而导致检测池破损)、试样扩散过大而不能实现循环功能。JAI的HPLC 可进行数十次循环，甚至可通过卓越的循环功能而实现结构异构体的分离。 2)采用 300mg 进样量重复进样，不会影响分析精度；在具备自动进样装置条件下，每天可收集多达20g的纯化样品。 3)普通制备 HPLC 使用的分析柱一般2年左右就需要更换新柱。JAI 的色谱柱使用聚合物系列填充物，因其吸附力弱，注入的试样不会在柱内残留，使用寿命比其他产品高出2倍以上，使用寿命超过六年，一般可使用六年到十年。(汉城大学生物工学科：10年；延世大学：14年；DongSung 化学：11年目前仍在使用中) 4)所配备的 UV 及RI检测器的动态范围很宽，分别配备分析柱和制备柱可以实现本系统分析、制备兼用。 5) JAI循环制备 HPLC 使用的 GPC 色谱柱理论塔板数很高，比普通的制备 HPLC分离性能好，溶剂使用量明显显少，仅为其他制备 LC 的十分之一，可以节省巨额的溶剂花费。 6)装备重复进样和自动循环等功能，设定好制备条件后可自动进样、循环分离，可以实现无人操作下的昼夜连续运转。 7)普通的制备色谱不具备循环功能不能实现难分离的糖类的制备，而JAI循环制备 HPLC 可以实现。这是因为糖类只有用 RI 检测器才能检出，其他公司的制备HPLC只有采用梯度法进行分离提纯，但梯度条件下RI检测器无法使用。 循环制备 HPLC分析案例 1)低聚糖 KFA 溶液 ★分析时间：2000年11月22日 ★试样： KFA溶液 ★制备目的：KFA溶液中的化合物分离/制备 ★分析设备：循环制备 HPLC (型号：LC-9101) ★分析条件：：色谱柱-JAIGEL W-252 柱(20Dx500mm) 泵流速一3.5mL/min 溶剂一纯水(色谱级) 试样注入量：200mg/3mL 检测器：RI检测器 ★结果： 注入上述试样3mL连续4次循环分析后，得到 Fig.1的图谱。 得到了 A、B、C、D、E五个制备物馏分，制备物馏分E 与标准试样的保留时间以及 NMR 波谱一致，确认为同一化合物(图) Fig.1 低聚糖(KFA溶液)的循环制备色谱 2)低聚糖A ★分析时间：：2001年12月12日 ★试样：低聚糖A ★制备目的：低聚糖的完全分离/制备 ★分析设备：循环制备HPLC(型号： LC-9101) ★分析条件：色谱柱-JAIGEL W-252 柱(200x500mm) 泵流速一3.5mL/min 溶剂一纯水(色谱级) 试样注入量： 200mg/3mL 检测器：RI检测器 ★结果： 注入上述试样 3mL 连续4次循环分析后，得到 Fig.2 的图谱。通过循环对低聚糖进行了完全的分离和制备。 Fig.2 低聚糖循环制备色谱 3) Ecdysteroid 系试样 ★分析时间：l：2001年6月7日 ★试样： Ecdysteroids ★制备目的： Ecdysteroids 的分离/制备 ★分析设备：循环制备HPLC (型号： LC-9201) ★分析条件：色谱柱一JAIGEL W-252xW-253 柱(20Dx500mm) 泵流速一3.5mL/min 溶剂一MeOH+MeCN： 6+4(色谱级) 试样注入量： 40mg/3mL 检测器： UV检测器 ★结果： 循环分析18次得到X、Y两个馏分，做到分离/制备(Fig.3)。 Fig.3 Ecdysteroid 的循环制备色谱图 4)冬虫夏草 ★分析时间：l： 2001年4月6日 ★试样： 冬虫夏草(黄金虫)提取物 ★分析目的：分离/制备 ★分析设备：循环制备 HPLC(型号：LC-9201) ★分析条件：色谱柱一JAIGEL 1Hx2H 柱(20x500mm) 泵流速一3.5mL/min 溶剂-CHCl 100%(色谱级) 试样注入量： 800mg/3mL 检测器：UV检测器 ★结果： 仅循环一次，就得到A、B两个分离/制备馏分。 将标准试样和制备物A、B馏分分别再注入后，确认为标准化合物。 Fig.4冬虫夏草(黄金虫)提取物的循环制备色谱 5)一般天然物(生理活性物质) ★分析时间：1999年10月13日 ★试样： 生理活性物质 ★制备目的：生理活性物质的完全分离和精制 ★分析设备：循环制备HPLC(型号：LC-9101) ★分析条件：色谱柱-JAIGEL GS-320 柱(20*500mm) 泵流速-5.0mL/min 溶剂-MeOH： MeCN=1：：1(色谱级) 试样注入量： 52.75mg/3mL 检测器：UV检测器(254nm)、RI检测器 ★结果： 将上述试样 105.5mg 在6mL 流动相溶剂中溶解并用 0.45pL 过滤器过滤后，注入3mL。经过3次循环得到4个峰值分离(Fig.5)。这些峰值与各自的纯品保留时间完全一致。 Fig.5 生理活性物质的循环制备色谱图 6) Saponin 皂角苷(药用人参提取物) ★分析时间：l：2001年2月5日 ★试样： 药用人参提取物(用 0.45uL 过滤器过滤) ★制备目的：通过对 Saponin 皂角苷的完全分离进行提纯/制备 ★分析设备：循环制备HPLC(型号： LC-9101) ★分析条件：制备柱-JAIGEL GS-310 柱×2(20x500mm) 分析柱-NH2(4.60×200mm) 泵流速-5.0mL/min 溶剂一MeOH： MeCN=1：1(色谱级) 检测器： UV检测器(203nm) ★结果： Fig.6 表示该试样 NH2柱的 HPLC 色谱。 将上述试样 104mg 在6mL流动相溶剂中溶解后，连接两根 JAIGEL柱，注入3mL试样溶液。 Fig.7 表示紫外检测器的循环制备色谱。为了将试样中拟分离的成分进行有效制备，先实施分区间制备，然后把区间C的部分循环两次，就得到完全提纯和制备。此外，相对于 HPLC色谱 (Fig.6)， 循环制备色谱 (Fig.7)的分离效果更佳。 Fig.6 药用人参提取物 NH2 柱的 HPLC 的色谱图 Fig.7 药用人参提取物(1)的循环制备色谱图 参考资料：人参的基本结构 7)西伯利亚产药用人参(Araliaceae 果)1 ★分析时间：2001年4月3日 ★试样： 西伯利亚产药用人参(1)(Araliaceae果)的提取物 ★制备目的：通过完全分离进行提纯/制备 ★分析设备：循环制备 HPLC(型号： LC-9101) ★分析条件：制备柱-JAIGEL GS-310 柱×2(200x500mm) 泵流速一3.5mL/min 溶剂-MeOH 100%(色谱级) 试样注入量： 300mg/3mL 检测器： UV 检测器(200nm)、RI检测器 ★结果： 将上述试样300mg 在3mL流动相溶剂中溶解后，用 0.45uL过滤器过滤，注入3mL试样。 实施分区间制备，通过2次循环将目标峰值完全进行了提纯/制备(Fig.8用RI检测器的检测结果)。 Fig.8 西伯利亚产药用人参(1)(Araliaceae 果)提取物的循环制备色谱 8)西伯利亚产药用人参 (Araliaceae 果)2 ★分析时间：2002年3月20日 ★试样： 西伯利亚产药用人参(2) (Araliaceae 果)的提取物 ★制备目的：通过完全分离进行提纯/制备 ★分析设备：循环制备HPLC (型号：LC-9201) ★分析条件：制备柱-JAIGEL ODS 柱×2(20x500mm) 泵流速一5mL/min 溶剂一H2O： MeOH： MeCN=80：：6：14(色谱级) 试样注入量：未知 检测器： UV检测器(210nm)、RI检测器 ★结果： 将上述试样在 3mL 流动相溶剂中溶解后，用 0.45uL 过滤器过滤，注入3mL试样。 第一步，将纯度约8%的西伯利亚产药用人参的 AcanthosideD制备，第二步，将制备的馏分再注入，得到纯度93%的 AcanthosideD 提纯和制备 (Fig.9) Fig.9 西伯利亚产药用人参(2)(Araliaceae 果)提取物的循环制备色谱图 9) Ethaboxam ★分析时间：l： 2001年9月7日 ★试样： Ethaboxam ★制备目的：：为确认杀菌效果，提纯/制备 ★分析设备：分析制备HPLC (型号：LC-9101) ★分析条件：制备柱-JAIGEL W-252 柱×2(20x500mm) 泵流速-3.5mL/min 溶剂一纯水：乙乙=7：3(色谱级) 试样注入：900mg/3mL 检测器： UV检测器(310nm) ★结果： 将上述试样 900mg 在3mL流动相溶剂中溶解后，用0.45uL过滤器过滤，注入3mL试样。 经过3次循环完成对目的化合物的提纯和制备(Fig.10)。 使用制备后的试样应用到2次临床试验。 Fig.10 Ethaboxam 的提纯 10) Taxol ★分析时间：1996年12月18日 ★试样： 松木提取物 ★制备目的：Taxol 的提纯/制备 ★分析设备：循环制备 HPLC (型号： LC-9101) ★分析条件：制备柱-JAIGEL GS-320 柱(20Dx500mm) 泵流速一4mL/min 溶剂-MeOH 检测器： UV检测器(229nm) ★结果： 将上述试样80mg 在 3mL 流动相溶剂中溶解后，用 0.45pL 过滤器过滤，注入3mL试样，得到 Fig.11 第一步的色谱。 将 Fig.11 第一步的 Taxol 部分区间制备后，再次注入装备 JAIGELODS 柱的 LC-9101 型循环制备液相色谱，在第二次循环制备 Taxol(Fig.11 第二步)。纯度测定结果达到95%以上。 Fig.11松木提取物的色谱(A)；；}再注入后的循环制备色谱(B) 11)淫羊藿 ★分析时间：|：2002年2月28日 ★试样： 淫羊藿提取物 ★制备目的：完全分离/制备 ★分析设备：循环制备 HPLC (型号： LC-9101) ★分析条件：制备柱-JAIGEL ODS 柱(200×250mm) 泵流速一5mL/min 溶剂-MeOH：纯水=7.5：2.5 试样注入： 40mg/mL 检测器：UV检测器(229nm) ★结果： 将上述试样 40mg 在3mL 流动相溶剂中溶解后，用 0.45uL 过滤器过滤，注入装备 JAIGEL W-252 柱的LC-9101 型 3mL试样，制备Icarrin 部分和 Epidomis A， 将其再次注入 JAIGEL ODS 柱，得到Fig.12 循环制备色谱。将所得到的 Icarrin 和 Epidomis A 进行纯度测定，结果分别达到95%以上。 Fig.12 淫羊藿提取物的循环制备色谱 12) Tagatose(塔格糖)， Galactose(半乳糖)的低聚物 ★分析时间：：2003年3月19日 ★试样： Tagatose(塔格糖)， Galactose(半乳糖)的低聚物 ★分析设备：循环制备HPLC (型号： LC-9101) ★分析条件：：色谱柱-JAIGEL W-252 柱(20Dx500mm) 泵流速一3mL/min 溶剂一纯水(色谱级) 试样注入量： 3mL 检测器： UV检测器(254nm)、RI检测器 ★结果： 将上述试样在3mL 流动相溶剂中溶解并用 0.45uL 过滤器过滤后，注入3mL。得到完全的分离制备。(Fig.13) Fig.13 Tagatose 和 Galactose 低聚物的循环制备色谱图 --